Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул
Summary
3D одномолекулярная микроскопия локализации используется для зондирования пространственных положений и траекторий движения флуоресцентно обозначенных белков в живых бактериальных клетках. Экспериментальный протокол анализа данных, описанный в данном документе, определяет распространенное диффузное поведение цитосолильных белков на основе объединенных одномолекулярных траекторий.
Abstract
Одномолекулярная локализационная микроскопия зондирует положение и движения отдельных молекул в живых клетках с десятками нанометров пространственного и миллисекундного височного разрешения. Эти возможности делают одномолекулярную микроскопию локализации идеально подходящей для изучения биологических функций молекулярного уровня в физиологически значимых средах. Здесь мы демонстрируем интегрированный протокол для приобретения и обработки/анализа данных отслеживания одной молекулы для извлечения различных диффузивных состояний, которые может проявлять сявряющий белок. Эта информация может быть использована для количественной оценки формирования молекулярного комплекса в живых клетках. Мы предоставляем подробное описание эксперимента по локализации на основе 3D-молекулы на основе камеры, а также последующих шагов по обработке данных, которые дают траектории отдельных молекул. Эти траектории затем анализируются с помощью численного анализа для извлечения распространенных диффузивных состояний флуоресцентно обозначенных молекул и относительного изобилия этих состояний. Основа анализа основана на стохастической моделировании внутриклеточных броуновских диффузионных траекторий, которые пространственно ограничены произвольной геометрией клеток. На основе смоделированных траекторий, сырые одномолекулярные изображения генерируются и анализируются так же, как экспериментальные изображения. Таким образом, экспериментальные ограничения точности и точности, которые трудно откалибровать экспериментально, явно включены в аналитический рабочий процесс. Коэффициент диффузии и относительные фракции населения в преобладающих диффузионных состояниях определяются путем установки распределения экспериментальных значений с использованием линейных комбинаций смоделированных распределений. Мы демонстрируем полезность нашего протокола путем разрешения диффузивных состояний белка, который проявляет различные диффузионные состояния при формировании гомо- и гетеро-олигомерных комплексов в цитозоле бактериального патогена.
Introduction
Изучение диффузивного поведения биомолекул дает представление об их биологических функциях. Методы, основанные на флуоресценции, стали ценными инструментами для наблюдения за биомолекулами в их родной клеточной среде. Восстановление флуоресценции после фотоотрубения (FRAP) и флуоресцентной корреляции спектроскопии (FCS)1 обеспечивают ансамбль-средний диффузивного поведения. И наоборот, одномолекулярная локализация микроскопии позволяет наблюдать за отдельными флуоресцентно отмеченными молекулами с высоким пространственным и временным разрешением2,3,4. Наблюдение отдельных молекул выгодно, так как интересующий белок может существовать в различных диффузивных состояниях. Например, два легко различимых диффузионных состояния возникают, когда транскрипционный регулятор, такой как CueR в Escherichia coli,свободно рассеивается в цитозоле или связывается с последовательностью ДНК и становится обездвижемым по шкале времени измерения5 . Одномолекулярное слежение обеспечивает инструмент для непосредственного наблюдения за этими различными состояниями, и для их разрешения не требуется сложных анализов. Тем не менее, становится все более сложным для решения нескольких диффузивных государств и их населения фракций в тех случаях, когда их диффузионные ставки более похожи. Например, из-за зависимости размера коэффициента диффузии различные состояния олигомеризации белка проявляются как различные диффузионные состояния6,7,8,9 , 10. Такие случаи требуют комплексного подхода с точки зрения сбора, обработки и анализа данных.
Критическим фактором, влияющим на диффузивные темпы цитосолильных молекул, является эффект заточения клеточной границы. Ограничения, наложенные на молекулярное движение границами бактериальных клеток, приводят к тому, что измеренная скорость диффузии цитосолильных молекул выглядит медленнее, чем если бы то же самое движение происходило в неограниченном пространстве. Для очень медленно рассеивающихся молекул эффект клеточного заточения незначителен из-за отсутствия столкновений с границей. В таких случаях, это может быть возможным для точного решения диффузионных состояний путем установки распределения молекулярных смещений, r, или очевидной диффузии коэффициенты, D ,с помощью аналитических моделей, основанных на уравнениях для броуновского движения ( случайная диффузия)11,12,13. Однако для быстро распространяющих цитосолильных молекул экспериментальные распределения больше не напоминают те, которые получены для неограниченного броуновского движения из-за столкновений диффузионных молекул с границами клеток. Эффекты заключения должны быть учтены для точного определения неограниченных коэффициентов диффузии флуоресцентно обозначенных молекул. Несколько подходов были недавно разработаны для учета последствий заключения либо (полу-) аналитически 5,14,15,16 или численно через Монте-Карло моделирования Броуновская диффузия6,10,16,17,18,19.
Здесь мы предоставляем интегрированный протокол для сбора и анализа данных одномолекулярной локализации микроскопии с особым акцентом на одномолекулярное отслеживание. Конечная цель протокола заключается в разрешении диффузивных состояний флуоресцентно обозначенных цитосолильных белков внутри, в данном случае, бактериальных клеток в форме стержня. Наша работа основывается на предыдущем протоколе для одномолекулярной слежения, в котором полимераза ДНК, PolI, было показано, существуют в ДНК связаны и несвязанное состояние диффузии анализа20. Здесь мы расширяем одномолекулярный анализ слежения до 3D-измерений и выполняем более реалистичные вычислительные симуляции для разрешения и количественной оценки нескольких диффузивных состояний, одновременно присутствующих в клетках. Данные приобретаются с помощью домашнего 3D супер-разрешение флуоресценции микроскоп, который способен определить 3D положение флуоресцентных излучателей с помощью изображения с двойной селипс точки распространения-функции (DHPSF)21,22. Необработанные одномолекулярные изображения обрабатываются с помощью специально написанного программного обеспечения для извлечения 3D одномолекулярных локализаций, которые затем объединяются в одномолекулярные траектории. Тысячи траекторий объединяются для генерации распределения явных коэффициентов диффузии. На последнем этапе экспериментальные дистрибутивы соответствуют численно генерируемым дистрибутивам, полученным с помощью моделирования броуновского движения Монте-Карло в ограниченном объеме. Мы применяем этот протокол для решения диффузивных состояний белка секреционной системы типа 3 Ysc, в живых Yersinia enterocolitica. Из-за своей модульной природы, наш протокол, как правило, применим к любому типу одномолекулярных или одночастиц слежения эксперимента в произвольной геометрии клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критическим фактором для успешного применения представленного протокола является обеспечение того, чтобы одномолекулярные сигналы были хорошо отделены друг от друга (т.е. они должны быть редкими в пространстве и во времени(Дополнительный Mov. 1)). Если в клетке одновременно нах?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Алеся Ахимович и Тингя Нан за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим Эда Холла (Ed Hall), старшего научного сотрудника группы Advanced Research Computing Services в Университете Вирджинии, за помощь в настройке процедур оптимизации, используемых в этой работе. Финансирование этой работы было предоставлено Университетом Вирджинии.
Materials
| 2,6-diaminopimelic acid | Chem Impex International | 5411 | Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used. |
| 4f lenses | Thorlabs | AC508-080-A | f = 80mm, 2" |
| 514 nm laser | Coherent | Genesis MX514 MTM | Use for fluorescence excitation |
| agarose | Inivtrogen | 16520100 | Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope. |
| ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | M2G ingredient. |
| bandpass filter | Chroma | ET510/bp | Excitation pathway. |
| Brain Heart Infusion | Sigma Aldrich | 53286 | Growth media for Y. enterocolitica. |
| calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | M2G ingredient. |
| camera | Imaging Source | DMK 23UP031 | Camera for phase contrast imaging. |
| dielectric phase mask | Double Helix, LLC | N/A | Produces DHPSF signal. |
| disodium phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | M2G ingredient. |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS. |
| flip mirror | Newport | 8892-K | Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways. |
| fluospheres | Invitrogen | F8792 | Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter. |
| glass cover slip | VWR | 16004-302 | #1.5, 22mmx22mm |
| glucose | Chem Impex International | 811 | M2G ingredient. |
| immersion oil | Olympus | Z-81025 | Placed on objective lens. |
| iron(II) sulfate | Sigma Aldrich | F0518 | M2G ingredient. |
| long pass filter | Semrock | LP02-514RU-25 | Emission pathway. |
| magnesium sulfate | Fisher Scientific | S25414A | M2G ingredient. |
| microscope platform | Mad City Labs | custom | Platform for inverted microscope. |
| nalidixic acid | Sigma Aldrich | N4382 | Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid. |
| objective lens | Olympus | 1-U2B991 | 60X, 1.4 NA |
| Ozone cleaner | Novascan | PSD-UV4 | Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips. |
| potassium phosphate | Sigma Aldrich | 795488 | M2G ingredient. |
| Red LED | Thorlabs | M625L3 | Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm. |
| sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA-Flash 4.0 V2 | Camera for fluorescence imaging. |
| short pass filter | Chroma | ET700SP-2P8 | Emission pathway. |
| Tube lens | Thorlabs | AC508-180-A | f=180 mm, 2" |
| Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd | N/A | N/A | Strain AD4442, eYFP-YscQ |
| zero-order quarter-wave plate | Thorlabs | WPQ05M-514 | Excitation pathway. |
References
- Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
- Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
- Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
- Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
- Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
- Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
- Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
- Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
- Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
- Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
- Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
- Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
- Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
- Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
- Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
- Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
- Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
- Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
- Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
- Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
- Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
- Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
- Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
- Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Berglund, A. J. Statistics of camera-based single-particle tracking. Physical Review E. 82 (1), 011917 (2010).
- Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
- English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
- Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
- Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
- Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
- Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
- Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).
