JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Published: September 05, 2019
doi:
10.3791/59387
,
1Department of Chemistry,University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics,University of Virginia School of Medicine

Summary

3D single-molecuul lokalisatie microscopie wordt gebruikt om de ruimtelijke posities en bewegings trajecten van fluorescently gelabelde eiwitten in levende bacteriële cellen te sonde. Het experimentele en data-analyse protocol dat hierin wordt beschreven, bepaalt het heersende diffusieve gedrag van cytosolische eiwitten op basis van gegroepeerde enkelvoudige molecuul trajecten.

Abstract

Enkele molecuul lokalisatie microscopie meet de positie en de bewegingen van individuele moleculen in levende cellen met tientallen nanometer ruimtelijke en temporele resolutie van de milliseconde. Deze mogelijkheden maken single-molecuul lokalisatie microscopie bij uitstek geschikt voor het bestuderen van de biologische functies van moleculaire niveaus in fysiologisch relevante omgevingen. Hier demonstreren we een geïntegreerd protocol voor zowel acquisitie en verwerking/analyse van single-molecule trackinggegevens om de verschillende diffusieve toestanden te extraheren die een eiwit van belang kan vertonen. Deze informatie kan worden gebruikt om moleculaire complexe vorming in levende cellen te kwantificeren. We bieden een gedetailleerde beschrijving van een op camera’s gebaseerd 3D-single-molecuul lokalisatie-experiment, evenals de daaropvolgende gegevensverwerkings stappen die de trajecten van individuele moleculen opleveren. Deze trajecten worden vervolgens geanalyseerd met behulp van een numeriek analysekader om de heersende diffusieve toestanden van de fluorescently gelabelde moleculen en de relatieve overvloed van deze toestanden te extraheren. Het analysekader is gebaseerd op stochastische simulaties van intracellulaire Brownian-diffusie trajecten die ruimtelijk worden beperkt door een willekeurige celgeometrie. Op basis van de gesimuleerde trajecten worden RAW-beelden van één molecuul gegenereerd en op dezelfde manier geanalyseerd als experimentele afbeeldingen. Op deze manier worden experimentele precisie-en nauwkeurigheids beperkingen, die experimenteel moeilijk te kalibreren zijn, expliciet opgenomen in de analyse-workflow. De diffusiecoëfficiënt en de relatieve bevolkings fracties van de heersende diffusieve toestanden worden bepaald door de verdelingen van experimentele waarden te monteren met behulp van lineaire combinaties van gesimuleerde verdelingen. We demonstreren het nut van ons protocol door het oplossen van de diffusieve toestanden van een eiwit dat verschillende diffusieve toestanden vertoont bij de vorming van homo-en hetero-oligomere complexen in de cytosol van een bacteriële pathogeen.

Introduction

Het onderzoeken van het diffusieve gedrag van biomoleules geeft inzicht in hun biologische functies. Fluorescentiemicroscopie gebaseerde technieken zijn waardevolle hulpmiddelen geworden voor het observeren van biomoleules in hun inheemse celomgeving. Fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) en fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS)1 bieden ensemble-gemiddeld diffusief gedrag. Omgekeerd, single-molecuul lokalisatie microscopie maakt observatie van individuele fluorescently gelabelde moleculen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie2,3,4. Het observeren van individuele moleculen is voordelig omdat er een eiwit van belang kan bestaan in verschillende diffusieve toestanden. Twee gemakkelijk te onderscheiden diffusie toestanden ontstaan bijvoorbeeld wanneer een transcriptionele regulator, zoals CueR in Escherichia coli, vrij verspreidt in de cytosol of zich bindt aan een DNA-sequentie en wordt geïmmobiliseerd op de tijdschaal van meting5 . Single-molecule tracking biedt een hulpmiddel voor het observeren van deze verschillende toestanden direct, en geavanceerde analyses zijn niet vereist om ze op te lossen. Het wordt echter uitdagender om meerdere diffusieve toestanden en hun bevolkings fracties op te lossen in gevallen waarin hun diffusieve percentages meer vergelijkbaar zijn. Bijvoorbeeld, als gevolg van de grootte afhankelijkheid van de diffusiecoëfficiënt, verschillende oligomerisatie toestanden van een eiwit manifesteren zich als verschillende diffusieve toestanden6,7,8,9 , 10. dergelijke gevallen vereisen een geïntegreerde aanpak op het gebied van gegevensverzameling,-verwerking en-analyse.

Een kritische factor die de diffusie graad van cytosolische moleculen beïnvloedt, is het effect van de opsluiting door de celgrens. De beperkingen op moleculaire beweging door een bacteriële celgrens zorgen ervoor dat de gemeten diffusiesnelheid van een cytosolische moleculen langzamer lijkt dan wanneer dezelfde beweging in een niet-afgesloten ruimte had plaatsgevonden. Voor zeer langzaam verstrooi moleculen is het effect van cellulaire opsluiting verwaarloosbaar als gevolg van het gebrek aan botsingen met de grens. In dergelijke gevallen kan het mogelijk zijn om de diffusieve toestanden nauwkeurig op te lossen door de verdelingen van moleculaire verplaatsingen, rof schijnbare diffusie coëfficiënten, D *, te gebruiken met behulp van analytische modellen op basis van de vergelijkingen voor de Brownse beweging ( willekeurige diffusie)11,12,13. Echter, voor snelle diffuus cytosolische moleculen lijken de experimentele distributies niet langer op die verkregen voor onbegrensde Brownse bewegingen als gevolg van botsingen met diffusen van moleculen met de celgrenzen. Opsluiting effecten moeten administratief worden verantwoord om nauwkeurig de niet-ingeperste diffusie coëfficiënten van de fluorescently gelabelde moleculen te bepalen. Er zijn recentelijk verschillende benaderingen ontwikkeld voor de opsluiting van effecten (semi-) analytisch 5,14,15,16 of numeriek via Monte Carlo simulaties van Brownian Diffusion6,10,16,17,18,19.

Hier bieden we een geïntegreerd protocol voor het verzamelen en analyseren van single-molecuul lokalisatie microscopie gegevens met een specifieke focus op single-molecule tracking. Het uiteindelijke doel van het protocol is het oplossen van diffusieve toestanden van fluorescently gelabelde cytosolische eiwitten binnen, in dit geval, staafvormige bacteriële cellen. Ons werk bouwt voort op een eerder protocol voor single-molecule tracking, waarbij een DNA-polymerase, PolI, werd aangetoond in een DNA gebonden en ongebonden toestand te bestaan door diffusie analyse20. Hier breiden we single-molecule tracking analyse uit naar 3D-metingen en voeren realistischer computationele simulaties uit om meerdere diffusieve toestanden tegelijk in cellen op te lossen en te kwantificeren. De gegevens worden verkregen met behulp van een huisgemaakte 3D super-resolution fluorescentiemicroscoop die in staat is om de 3D positie van fluorescerende stralers te bepalen door beeldvorming met de Double-Helix punt-spread-functie (dhpsf)21,22. De RAW-beelden van één molecuul worden verwerkt met behulp van op maat gemaakte software om de lokalisaties van de 3D-single-molecule te extraheren, die vervolgens worden gecombineerd in trajecten met één molecuul. Duizenden trajecten worden samengevoegd om distributies van schijnbare diffusie coëfficiënten te genereren. In een laatste stap, de experimentele distributies zijn fit met numeriek gegenereerde distributies verkregen door Monte-Carlo simulaties van de Brownian beweging in een beperkt volume. We passen dit protocol toe om de diffusieve toestanden van het type 3-secretie systeem proteïne YscQ in levende Yersinia enterocoliticaop te lossen. Vanwege de modulaire aard ervan, is ons protocol algemeen toepasbaar op elk type Single-molecule of één-deeltje tracking experiment in willekeurige celgeometrieën.

Protocol

1. Double-Helix Point-spread-functie kalibratie Opmerking: afbeeldingen die in deze en de volgende secties worden beschreven, worden verkregen met behulp van een op maat gemaakte omgekeerde fluorescentiemicroscoop, zoals beschreven in Rocha et al.23. Dezelfde procedure is van toepassing op verschillende Microscoop implementaties die zijn ontworpen voor lokalisatie van single-molecule en tracking microscopie2,3<sup…

Representative Results

Onder de hier beschreven experimentele omstandigheden (20.000 frames, trajectlengte minimaal 4 lokalisaties) en afhankelijk van de expressieniveaus van de fluorescently gelabelde fusie eiwitten, ongeveer 200-3000 lokalisaties opleveren 10-150 trajecten kunnen per cel worden gegenereerd (Figuur 2a, b). Een groot aantal trajecten is nodig om een goed gesamplede verdeling van schijnbare diffusie coëfficiënten te produceren. De grootte van FOV …

Discussion

Een cruciale factor voor de succesvolle toepassing van het gepresenteerde protocol is om ervoor te zorgen dat signalen van één molecuul goed van elkaar gescheiden zijn (d.w.z. dat ze schaars moeten zijn in de ruimte en in de tijd (aanvullende MOV. 1)). Als er meer dan één fluorescerende molecuul in een cel tegelijkertijd is, dan kan de lokalisatie onjuist worden toegewezen aan een ander traject van de moleculen. Dit wordt het koppelingsprobleem30genoemd. Experimentele omstandi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Alecia Achimovich en ting Yan voor de kritische lezing van het manuscript. We bedanken Ed Hall, senior staff Scientist in de Advanced Research Computing Services Group van de University of Virginia, voor hulp bij het opzetten van de optimalisatie routines die in dit werk worden gebruikt. De financiering van dit werk werd verzorgd door de Universiteit van Virginia.

Materials

2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  5. Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
  6. Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
  7. Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
  8. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  9. Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
  10. Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
  11. Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
  12. Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
  13. Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
  14. Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
  15. Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
  16. Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
  17. Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
  18. Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
  19. Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
  20. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
  21. Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
  22. Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
  23. Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
  24. Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
  25. Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
  26. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
  27. Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
  28. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
  29. Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
  30. Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
  31. Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
  32. Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  33. Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
  34. Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
  35. Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
  36. Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
  37. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  38. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  39. Berglund, A. J. Statistics of camera-based single-particle tracking. Physical Review E. 82 (1), 011917 (2010).
  40. Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
  41. English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
  42. Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
  43. Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
  44. Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
  45. Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
  46. Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).

Tags

Single-molecule Tracking3D TrackingDiffusive StatesCytosolic MoleculesFluorescence MicroscopyAgarose PadYersinia EnterocoliticaCell VolumeZ-calibrationMATLABHCImage Live

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image