Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç
Summary
3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.
Abstract
Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, onlarca nanometre uzamsal ve milisaniye zamansal çözünürlükle canlı hücrelerdeki tek tek moleküllerin pozisyonunu ve hareketlerini inceler. Bu yetenekler, fizyolojik olarak ilgili ortamlarda moleküler düzeydebiyolojik fonksiyonları incelemek için tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu ideal hale getirmektedir. Burada, ilgi çekici bir proteinin sergileneebileceği farklı difüzif durumları ayıklamak için tek moleküllü izleme verilerinin hem elde edilmesi hem de işlenmesi/analizi için entegre bir protokol gösteriyoruz. Bu bilgiler canlı hücrelerdeki moleküler karmaşık oluşumu ölçmek için kullanılabilir. Kamera tabanlı 3D tek moleküllü yerelleştirme deneyinin ayrıntılı bir açıklamasını ve tek tek moleküllerin yörüngelerini sağlayan sonraki veri işleme adımlarını salıyoruz. Bu yörüngeler daha sonra floresan etiketli moleküllerin yaygın diffusive durumları ve bu devletlerin göreceli bolluk ayıklamak için sayısal bir analiz çerçevesi kullanılarak analiz edilir. Analiz çerçevesi, rasgele hücre geometrisi ile uzaysal olarak sınırlı olan hücre içi Browndifüzyon yörüngelerinin stokakstik simülasyonlarına dayanmaktadır. Simüle edilen yörüngelere dayanarak, ham tek moleküllü görüntüler deneysel görüntülerle aynı şekilde üretilir ve analiz edilir. Bu şekilde, deneysel olarak kalibre edilmesi zor olan deneysel hassasiyet ve doğruluk sınırlamaları, analiz iş akışına açıkça dahil edilir. Yaygın difüzyon katsayısı ve yaygın diffüzif durumların göreli popülasyon fraksiyonları, simüle edilmiş dağılımların doğrusal kombinasyonları kullanılarak deneysel değerlerin dağılımları uygun hale alınarak belirlenir. Bakteriyel bir patojenin sitosolunda homo- ve hetero-oligomerik kompleksler oluşturarak farklı diffusive durumları sergileyen bir proteinin diffüzif durumlarını çözerek protokolümüzün yararını gösteriyoruz.
Introduction
Biyomoleküllerin diffüzif davranışlarının incelenmesi biyolojik işlevlerihakkında bilgi sağlar. Floresan mikroskobu tabanlı teknikler kendi doğal hücre ortamında biyomolekülleri gözlemlemek için değerli araçlar haline gelmiştir. Fotobeyazrlama (FRAP) ve floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) 1 sonrası floresan iyileşme1 topluluk ortalama difüzif davranışlar sağlar. Tersine, tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük2,3,4ile bireysel floresan etiketli moleküllerin gözlem sağlar. İlgi çekici bir protein farklı diffüzive durumlarda var olabileceğinden, moleküllerin tek tek gözlemlemesi avantajlıdır. Örneğin, escherichia coli’dekiCueR gibi transkripsiyonel regülatörün sitosolda serbestçe dağıldığında veya DNA dizisine bağlandığında ve ölçüm zaman ölçeğinde hareketsiz hale geldiğinde, kolayca ayırt edilebilir iki difüzif durum ortaya çıkar5 . Tek moleküllü izleme, bu farklı durumları doğrudan gözlemlemek için bir araç sağlar ve bunları çözmek için karmaşık analizler gerekmez. Ancak, diffusive oranları daha benzer olduğu durumlarda birden fazla diffusive durumları ve nüfus fraksiyonları çözmek için daha zor hale gelir. Örneğin, difüzyon katsayısının boyut bağımlılığı nedeniyle, bir proteinin farklı oligomerizasyon durumları farklı diffusive durumları olarak kendini gösterir6,7,8,9 , 10. Bu gibi durumlarda veri toplama, işleme ve analiz açısından entegre bir yaklaşım gerektirir.
Sitosolik moleküllerin diffüzive oranlarını etkileyen kritik bir faktör hücre sınırı tarafından hapsedilmesinin etkisidir. Bir bakteri hücresi sınırının moleküler hareketine konan kısıtlamalar, sitosolik moleküllerin ölçülen difüzyon hızının, aynı hareketin sınırlandırılmamış bir alanda meydana gelmemiş olduğundan daha yavaş görünmesine neden olur. Çok yavaş difüzyon molekülleriçin, hücresel hapsi etkisi sınır ile çarpışma eksikliği nedeniyle ihmal edilebilir. Bu gibi durumlarda, brown hareketi denklemlerine dayalı analitik modeller kullanarak moleküler yer değiştirme, rveya belirgin difüzyon katsayıları, D*dağılımlarını uygun olarak diffüz durumlarını doğru bir şekilde çözmek mümkün olabilir ( rastgele difüzyon)11,12,13. Ancak, hızlı difüzyon sitosolik moleküller için, deneysel dağılımları artık hücre sınırları ile difüzyon moleküllerin çarpışmaları nedeniyle sınırsız Brownhareketi için elde edilen benzer. Floresan etiketli moleküllerin sınırlandırılmamış difüzyon katsayılarını doğru bir şekilde belirlemek için hapsedilme etkileri göz önünde bulundurulmalıdır. Çeşitli yaklaşımlar son zamanlarda hapsi etkileri ya (yarı-) analitik 5,14,15,16 veya sayısal Monte Carlo simülasyonları aracılığıyla hesap geliştirilmiştir Browndifüzyon6,10,16,17,18,19.
Burada, tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu verilerinin toplanması ve analiz iã§in tek moleküllü izleme ã1/4zerinde durularak entegre bir protokol saÄ lık edeÄ izdir. Protokolün nihai amacı, bu durumda, çubuk şeklindeki bakteri hücrelerinin içinde floresan etiketli sitosolik proteinlerin diffüzif durumları çözmektir. Çalışmalarımız tek moleküllü izleme için bir önceki protokol üzerine inşa, hangi bir DNA polimeraz, PolI, difüzyon analizi20ile DNA bağlı ve bağlı olmayan durumda var olduğu gösterilmiştir. Burada, tek moleküllü izleme analizini 3B ölçümlere genişletiyoruz ve hücrelerde aynı anda bulunan birden fazla diffüzive durumu çözmek ve ölçmek için daha gerçekçi hesaplamalı simülasyonlar gerçekleştiriyoruz. Veriler çift sarmal nokta-yayma fonksiyonu (DHPSF)21,22ile görüntüleme ile floresan yayıcıların 3D konumunu belirleme yeteneğine sahip bir ev yapımı 3D süper çözünürlüklü floresan mikroskop kullanılarak elde edilir. Ham tek moleküllü görüntüler, 3B tek moleküllü yerelleştirmeleri ayıklamak için özel yazılmış yazılım kullanılarak işlenir ve bunlar daha sonra tek moleküllü yörüngelerde birleştirilir. Binlerce yörünge, görünürdidifüzyon katsayıları dağılımları oluşturmak için bir araya toplandı. Son bir adımda, deneysel dağılımlar sınırlı bir hacimde Brown hareketinin Monte-Carlo simülasyonları yoluyla elde edilen sayısal olarak oluşturulan dağılımlarla uyum sağlar. Biz yaşayan Yersinia enterocoliticaTip 3 salgı sistemi protein YscQ diffüzif durumları çözmek için bu protokolü uygulamak. Modüler yapısı nedeniyle, protokolümüz genellikle rasgele hücre geometrilerinde her türlü tek moleküllü veya tek parçacık izleme deneyi için geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için kritik bir faktör, tek moleküllü sinyallerin birbirinden iyi ayrılmasını sağlamaktır (yani, uzayda ve zamanda seyrek olmaları gerekir(Ek Mov. 1)). Bir hücrede aynı anda birden fazla floresan molekül varsa, lokalizasyon başka moleküllerin yörüngesine yanlış atanabilir. Bu bağlantı sorunu30olarak adlandırılır. Bağlanma problemini önlemek için protein ekspresyonu düzeyleri ve uyarma lazer yoğu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El yazmasının eleştirel okuması için Alecia Achimovich ve Ting Yan’a teşekkür ederiz. Biz Ed Hall, Virginia Üniversitesi’nde İleri Araştırma Bilgi İşlem Hizmetleri grubunda kıdemli personel bilim adamı, bu çalışmada kullanılan optimizasyon rutinleri kurma konusunda yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma için finansman Virginia Üniversitesi tarafından sağlanmıştır.
Materials
| 2,6-diaminopimelic acid | Chem Impex International | 5411 | Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used. |
| 4f lenses | Thorlabs | AC508-080-A | f = 80mm, 2" |
| 514 nm laser | Coherent | Genesis MX514 MTM | Use for fluorescence excitation |
| agarose | Inivtrogen | 16520100 | Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope. |
| ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | M2G ingredient. |
| bandpass filter | Chroma | ET510/bp | Excitation pathway. |
| Brain Heart Infusion | Sigma Aldrich | 53286 | Growth media for Y. enterocolitica. |
| calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | M2G ingredient. |
| camera | Imaging Source | DMK 23UP031 | Camera for phase contrast imaging. |
| dielectric phase mask | Double Helix, LLC | N/A | Produces DHPSF signal. |
| disodium phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | M2G ingredient. |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS. |
| flip mirror | Newport | 8892-K | Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways. |
| fluospheres | Invitrogen | F8792 | Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter. |
| glass cover slip | VWR | 16004-302 | #1.5, 22mmx22mm |
| glucose | Chem Impex International | 811 | M2G ingredient. |
| immersion oil | Olympus | Z-81025 | Placed on objective lens. |
| iron(II) sulfate | Sigma Aldrich | F0518 | M2G ingredient. |
| long pass filter | Semrock | LP02-514RU-25 | Emission pathway. |
| magnesium sulfate | Fisher Scientific | S25414A | M2G ingredient. |
| microscope platform | Mad City Labs | custom | Platform for inverted microscope. |
| nalidixic acid | Sigma Aldrich | N4382 | Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid. |
| objective lens | Olympus | 1-U2B991 | 60X, 1.4 NA |
| Ozone cleaner | Novascan | PSD-UV4 | Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips. |
| potassium phosphate | Sigma Aldrich | 795488 | M2G ingredient. |
| Red LED | Thorlabs | M625L3 | Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm. |
| sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA-Flash 4.0 V2 | Camera for fluorescence imaging. |
| short pass filter | Chroma | ET700SP-2P8 | Emission pathway. |
| Tube lens | Thorlabs | AC508-180-A | f=180 mm, 2" |
| Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd | N/A | N/A | Strain AD4442, eYFP-YscQ |
| zero-order quarter-wave plate | Thorlabs | WPQ05M-514 | Excitation pathway. |
References
- Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
- Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
- Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
- Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
- Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
- Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
- Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
- Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
- Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
- Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
- Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
- Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
- Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
- Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
- Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
- Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
- Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
- Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
- Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
- Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
- Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
- Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
- Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
- Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Berglund, A. J. Statistics of camera-based single-particle tracking. Physical Review E. 82 (1), 011917 (2010).
- Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
- English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
- Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
- Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
- Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
- Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
- Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).
