מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג
Summary
3D מיקרוסקופ לוקליזציה יחיד מולקולה מנוצל כדי לחקור את המיקומים מרחבי ומסלולי תנועה של חלבונים המסומנים באנרגיה בתאי בקטריאלי חיים. פרוטוקול ניתוח הנתונים הניסיוני והמידע המתואר להלן קובע את ההתנהגויות התפוצזות הנפוצות של חלבונים ציטוסולמים בהתבסס על מסלולים בעלי מולקולה בודדת.
Abstract
מיקרוסקופ חד-מולקולות לוקליזציה מטפל בעמדה ובתנועות של מולקולות בודדות בתאים חיים עם עשרות ברזולוציה מרחבית ומאלפית שניה של נאנמטר. יכולות אלה הופכים מיקרוסקופ חד-מולקולות לוקליזציה מתאים באופן אידיאלי לחקר פונקציות ביולוגיות ברמה המולקולרית בסביבות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. כאן, אנו מדגימים פרוטוקול משולב עבור רכישת ועיבוד/ניתוח של מולקולה בודדת מעקב נתונים כדי לחלץ את המצבים המפזרים שונים חלבון הריבית עשוי להפגין. מידע זה ניתן להשתמש כדי לכמת היווצרות קומפלקס מולקולרי בתאי החיים. אנו מספקים תיאור מפורט של ניסוי לוקליזציה של מולקולה בודדת תלת-ממד המבוסס על המצלמה, כמו גם את הצעדים הבאים עיבוד נתונים התשואה מסלולים של מולקולות בודדות. מסלולים אלה נותחו לאחר מכן באמצעות מסגרת ניתוח מספרית כדי לחלץ את המצבים המפזרים הנפוצים של מולקולות המסומנות באמצעות פלואורוסקופים ואת השפע היחסי של מצבים אלה. מסגרת הניתוח מתבססת על סימולציות סטוכסטיים של מסלולים בראוניים מתחום הדיפוזיה התאית, אשר מוגבלים בגיאומטריה של תאים שרירותיים. בהתבסס על מסלולים מדומים, תמונות raw מולקולה אחת נוצרות ונותחו באותו אופן כמו תמונות ניסיוני. בדרך זו, מגבלות דיוק ודיוק נסיוניות, שקשה לכייל את הניסוי, משולבים באופן מפורש בתהליך הניתוח. מקדם הדיפוזיה ושברי האוכלוסיה היחסיים של מדינות הפיזור הנפוצות נקבעים על-ידי התאמת הפצות הערכים הניסיוניים באמצעות שילובים ליניאריים של הפצות מדומה. אנו מדגימים את השירות של הפרוטוקול שלנו על ידי פתרון המצבים המפזרים של חלבון אשר מציג מצבים מפזרים שונים על יצירת הומו-והטרוסקסואל מתחמים oligomeric ב ציטוסול של פתוגן חיידקי.
Introduction
בחינת ההתנהגות הbiomolecules מספקת תובנה לתפקודים הביולוגיים. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית מבוססי הפכו כלים יקרי ערך להתבוננות biomolecules בסביבת התא יליד שלהם. התאוששות פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) ו ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (FCS)1 לספק התנהגויות ממוצעים של הרכב. לעומת זאת, מיקרוסקופ חד-מולקולות לוקליזציה מאפשר התבוננות של מולקולות מתויגות בודדות עם שתייגת מרחבית גבוהה וברזולוציה טמפורלית2,3,4. התבוננות במולקולות בודדות היא יתרון מאחר שחלבון של עניין עשוי להתקיים במצבים מפזרים שונים. לדוגמה, שני מצבים מפזרים בקלות מופיעים כאשר מווסת משתנה, כגון CueR ב- es,מפזר באופן חופשי בציטוזול, או נקשר לרצף דנ א והופך להיות מאוגד על ציר הזמן של מדידה5 . מעקב באמצעות מולקולה בודדת מספק כלי להתבוננות ישירה במצבים שונים אלה, וניתוחים מתוחכמים אינם נדרשים לפתרונן. עם זאת, הוא הופך ליותר מאתגר לפתור מצבים מפזרים מרובים ושברי האוכלוסייה שלהם במקרים שבהם שיעורי התפוצתם דומים יותר. לדוגמה, בשל התלות בגודל של מקדם הדיפוזיה, מדינות האויגמרים שונות של חלבון מתגלשות את עצמן כמצבים מפזרים שונים6,7,8,9 , 10. מקרים כאלה דורשים גישה משולבת במונחים של רכישת נתונים, עיבוד וניתוח.
גורם קריטי המשפיע על שיעורי התפוצו של מולקולות ציטוסולג היא השפעת הכליאה בגבול התא. ההגבלות המוטלות על תנועה מולקולרית על ידי גבול תא חיידקי לגרום מולקולות ציטוסולריות נמדד שיעור דיפוזיה להופיע איטי יותר מאשר אם התנועה אותה התרחשה בחלל לא סגור. עבור מולקולות מאוד איטיות, ההשפעה של הכליאה התאית היא זניחה עקב חוסר התנגשויות עם הגבול. במקרים כאלה, ייתכן שיהיה אפשר לפתור במדויק מצבים מפזרים על ידי התאמת ההפצות של displacements מולקולרית, rאו מקדמי דיפוזיה לכאורה, D *, באמצעות מודלים אנליטיים המבוססים על המשוואות לתנועה בראונית ( דיפוזיה אקראית)11,12,13. עם זאת, לצורך הפצת מולקולות ציטוסוליות מהירות, ההפצות הנסיוניות כבר אינן דומות לאלה שהתקבלו לתנועה בראונית לא מוגבלת עקב התנגשויות של מולקולות מדומות עם גבולות התא. יש לבדוק את השפעות הכליאה כדי לקבוע במדויק את מקדמי הדיפוזיה הבלתי מוגבל של המולקולות המסומנות בתווית הפלואורוסקופים. מספר גישות פותחו לאחרונה לחשבון עבור הכליאה השפעות או (semi-) באופן אנליסטי 5,14,15,16 או מספרית דרך סימולציות מונטה קרלו של דיפוזיה בראונית6,10,16,17,18,19.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול משולב לאיסוף וניתוח נתוני מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה אחת בדגש מסוים על מעקב יחיד-מולקולה. המטרה הסופית של הפרוטוקול היא לפתור מצבים מפזרים של חלבונים ציטוסקופים בעלי שם התווית בתוך, במקרה זה, תאים חיידקיים בצורת מוט. העבודה שלנו בונה על פרוטוקול קודם עבור מעקב חד מולקולות, שבו DNA פולימראז, PolI, הוכח להתקיים ב-DNA מאוגד ומצב לא מאוגד על ידי ניתוח דיפוזיה20. כאן, אנו מרחיבים ניתוח מעקב חד-מולקולות למדידות תלת-ממדית ומבצעים סימולציות חישוביות ריאליות יותר כדי לפתור ולכמת מספר רב של מצבים מפזרים בו המצויים בתאים. הנתונים נרכשים באמצעות ביתי בנוי 3d ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ פלורסנט אשר מסוגל לקבוע את מיקום 3d של הפולטים פלואורסצנט על ידי הדמיה עם הסליל כפול הפריסה-פונקציה (dhpsf)21,22. התמונות raw-מולקולה בודדת מעובדות באמצעות תוכנה כתובה מותאמת אישית כדי לחלץ את 3D מולקולה חד-ממדית לוקליזציה, אשר משולבים אז לתוך המולקולה יחיד מסלולים. אלפי מסלולים ממאגר להפקת הפצות של מקדמי דיפוזיה לכאורה. בשלב האחרון, ההפצות הנסיוניות מתאימות להפצות שהופקו באמצעות מספרים שהתקבלו באמצעות סימולציות מונטה-קרלו של תנועה בראונית בכרך מוגבל. אנו מיישמים פרוטוקול זה כדי לפתור את המצבים המפזרים של הפרשה סוג 3 חלבון מערכת YscQ בחיים Yersinia בידור. בשל אופיו המודולרי, הפרוטוקול שלנו מתאים בדרך כלל לכל סוג של ניסוי מעקב יחיד או חלקיק בודד, באמצעות מערכות שרירותיות המתאימות לתאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
גורם קריטי ליישום המוצלח של הפרוטוקול המוצג הוא לוודא שאותות מולקולות בודדות מופרדים היטב זה מזה (כלומר, הם צריכים להיות דלילים בחלל ובזמן (Mov משלימים 1)). אם יש יותר ממולקולה רואה אחת בתא באותו זמן, לוקליזציה ניתן להקצות באופן שגוי מסלול אחר של מולקולות. הדבר נקרא בעיית הקישור<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אלישה אחמוביץ ‘ וטינג יאן על הקריאה הקריטית של כתב היד. אנו מודים לאד הול, מדען סגל בכיר בקבוצת שירותי המחשוב המתקדם באוניברסיטת וירג, לקבלת עזרה בהקמת רוטינות האופטימיזציה המשמשות בעבודה זו. המימון לעבודה זו סופק על ידי אוניברסיטת וירג.
Materials
| 2,6-diaminopimelic acid | Chem Impex International | 5411 | Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used. |
| 4f lenses | Thorlabs | AC508-080-A | f = 80mm, 2" |
| 514 nm laser | Coherent | Genesis MX514 MTM | Use for fluorescence excitation |
| agarose | Inivtrogen | 16520100 | Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope. |
| ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | M2G ingredient. |
| bandpass filter | Chroma | ET510/bp | Excitation pathway. |
| Brain Heart Infusion | Sigma Aldrich | 53286 | Growth media for Y. enterocolitica. |
| calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | M2G ingredient. |
| camera | Imaging Source | DMK 23UP031 | Camera for phase contrast imaging. |
| dielectric phase mask | Double Helix, LLC | N/A | Produces DHPSF signal. |
| disodium phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | M2G ingredient. |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS. |
| flip mirror | Newport | 8892-K | Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways. |
| fluospheres | Invitrogen | F8792 | Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter. |
| glass cover slip | VWR | 16004-302 | #1.5, 22mmx22mm |
| glucose | Chem Impex International | 811 | M2G ingredient. |
| immersion oil | Olympus | Z-81025 | Placed on objective lens. |
| iron(II) sulfate | Sigma Aldrich | F0518 | M2G ingredient. |
| long pass filter | Semrock | LP02-514RU-25 | Emission pathway. |
| magnesium sulfate | Fisher Scientific | S25414A | M2G ingredient. |
| microscope platform | Mad City Labs | custom | Platform for inverted microscope. |
| nalidixic acid | Sigma Aldrich | N4382 | Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid. |
| objective lens | Olympus | 1-U2B991 | 60X, 1.4 NA |
| Ozone cleaner | Novascan | PSD-UV4 | Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips. |
| potassium phosphate | Sigma Aldrich | 795488 | M2G ingredient. |
| Red LED | Thorlabs | M625L3 | Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm. |
| sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA-Flash 4.0 V2 | Camera for fluorescence imaging. |
| short pass filter | Chroma | ET700SP-2P8 | Emission pathway. |
| Tube lens | Thorlabs | AC508-180-A | f=180 mm, 2" |
| Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd | N/A | N/A | Strain AD4442, eYFP-YscQ |
| zero-order quarter-wave plate | Thorlabs | WPQ05M-514 | Excitation pathway. |
References
- Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
- Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
- Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
- Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
- Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
- Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
- Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
- Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
- Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
- Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
- Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
- Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
- Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
- Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
- Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
- Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
- Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
- Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
- Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
- Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
- Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
- Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
- Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
- Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Berglund, A. J. Statistics of camera-based single-particle tracking. Physical Review E. 82 (1), 011917 (2010).
- Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
- English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
- Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
- Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
- Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
- Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
- Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).
