Microscopie de suivi à molécule unique - Outil pour déterminer les états diffusifs des molécules cytosoliques

L’examen du comportement diffusif des biomolécules donne un aperçu de leurs fonctions biologiques. Les techniques basées sur la microscopie à fluorescence sont devenues des outils précieux pour observer les biomolécules dans leur environnement cellulaire indigène. Le rétablissement de fluorescence après le photoblanchiment (FRAP) et la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)¹ fournissent des comportements diffusifs ensemble-moyens. Inversement, la microscopie de localisation à molécule unique permet l’observation de molécules fluorescentes individuelles à haute résolution spatiale et temporelle^2,3,4. L’observation de molécules individuelles est avantageuse puisqu’une protéine d’intérêt peut exister dans différents états diffusifs. Par exemple, deux états diffusables facilement reconnaissables surgissent lorsqu’un régulateur transcriptionnel, tel que CueR dans Escherichia coli, se diffuse librement dans le cytosol ou se lie à une séquence d’ADN et devient immobilisé sur l’échelle de temps de la mesure⁵ . Le suivi à molécule unique fournit un outil pour observer ces différents états directement, et des analyses sophistiquées ne sont pas nécessaires pour les résoudre. Cependant, il devient plus difficile de résoudre plusieurs états diffusifs et leurs fractions de population dans les cas où leurs taux de diffusion sont plus semblables. Par exemple, en raison de la dépendance de taille du coefficient de diffusion, différents états d’oligomerisation d’une protéine se manifestent comme différents états diffusifs^{6,7,8,9 , 10}. De tels cas nécessitent une approche intégrée en termes d’acquisition, de traitement et d’analyse des données.

Un facteur critique influençant les taux de diffusion des molécules cytosoliques est l’effet de confinement par la limite cellulaire. Les restrictions imposées au mouvement moléculaire par une limite cellulaire bactérienne font apparaître le taux de diffusion mesuré d’une molécule cytoslique plus lent que si le même mouvement s’était produit dans un espace non confiné. Pour les molécules qui diffusent très lentement, l’effet du confinement cellulaire est négligeable en raison de l’absence de collisions avec la limite. Dans de tels cas, il peut être possible de résoudre avec précision les états diffusifs en adaptant les distributions des déplacements moléculaires, r, ou des coefficients de diffusion apparents, D ,en utilisant des modèles analytiques basés sur les équations pour le mouvement Brownian ( diffusion aléatoire)^11,12,13. Cependant, pour la diffusion rapide des molécules cytosoliques, les distributions expérimentales ne ressemblent plus à celles obtenues pour le mouvement Brownien non confiné en raison des collisions de molécules diffusantes avec les limites cellulaires. Les effets de confinement doivent être pris en compte pour déterminer avec précision les coefficients de diffusion non confinés des molécules étiquetées fluorescentes. Plusieurs approches ont récemment été développées pour tenir compte des effets de confinement soit (semi-)analytiquement ^5,14,15,16 ou numériquement grâce à des simulations de Monte Carlo de Diffusion Brownian^{6,10,16,17,18,19}.

Ici, nous fournissons un protocole intégré pour la collecte et l’analyse des données de microscopie de localisation à molécule unique avec un accent particulier sur le suivi d’une seule molécule. L’objectif final du protocole est de résoudre les états diffusifs des protéines cytosoliques étiquetées fluorescentes à l’intérieur, dans ce cas, des cellules bactériennes en forme de tige. Notre travail s’appuie sur un protocole précédent pour le suivi d’une seule molécule, dans lequel une polymérase d’ADN, PolI, a été montrée pour exister dans un état lié et non lié d’ADN par l’analyse de diffusion²⁰. Ici, nous étendons l’analyse de suivi d’une seule molécule aux mesures 3D et effectuons des simulations de calcul plus réalistes pour résoudre et quantifier les états diffusifs multiples simultanément présents dans les cellules. Les données sont acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence 3D maison qui est capable de déterminer la position 3D des émetteurs fluorescents par l’imagerie avec la double hélice point-spread-fonction (DHPSF)^21,22. Les images brutes à molécule unique sont traitées à l’aide d’un logiciel écrit sur mesure pour extraire les localisations 3D à molécule unique, qui sont ensuite combinées en trajectoires monomolécules. Des milliers de trajectoires sont mises en commun pour générer des distributions de coefficients de diffusion apparents. Dans une dernière étape, les distributions expérimentales s’adaptent aux distributions générées numériquement obtenues grâce aux simulations De Monte-Carlo du mouvement Brownian dans un volume confiné. Nous appliquons ce protocole pour résoudre les états diffusifs de la protéine de système de sécrétion de type 3 YscQ dans la vie Yersinia enterocolitica. En raison de sa nature modulaire, notre protocole s’applique généralement à tout type d’expérience de suivi à une molécule ou à une seule particule dans des géométries cellulaires arbitraires.