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Biochemistry

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Published: September 05, 2019
doi:
10.3791/59387
,
1Department of Chemistry,University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics,University of Virginia School of Medicine

Summary

Die 3D-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie wird verwendet, um die räumlichen Positionen und Bewegungsbahnen fluoreszierend markierter Proteine in lebenden Bakterienzellen zu untersuchen. Das hier beschriebene experimentelle und Datenanalyseprotokoll bestimmt das vorherrschende diffusive Verhalten von zytosolischen Proteinen auf der Grundlage gepoolter Einzelmolekülbahnen.

Abstract

Die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie untersucht die Position und Bewegungen einzelner Moleküle in lebenden Zellen mit einer räumlichen und Millisekunden-Zeitlichen Auflösung von Zehnmetern Nanometer. Diese Fähigkeiten machen die Einmolekül-Lokalisationsmikroskopie ideal geeignet, um biologische Funktionen auf molekularer Ebene in physiologisch relevanten Umgebungen zu untersuchen. Hier zeigen wir ein integriertes Protokoll zur Erfassung und Verarbeitung/Analyse von Single-Molekül-Tracking-Daten, um die verschiedenen diffusiven Zustände zu extrahieren, die ein Protein von Interesse aufweisen kann. Diese Informationen können verwendet werden, um molekulare komplexe Bildung in lebenden Zellen zu quantifizieren. Wir bieten eine detaillierte Beschreibung eines kamerabasierten 3D-Einzelmolekül-Lokalisierungsexperiments sowie der nachfolgenden Datenverarbeitungsschritte, die die Bahnen einzelner Moleküle ergeben. Diese Bahnen werden dann mit hilfe eines numerischen Analyserahmens analysiert, um die vorherrschenden diffusiven Zustände der fluoreszierend markierten Moleküle und die relative Häufigkeit dieser Zustände zu extrahieren. Das Analyseframework basiert auf stochastischen Simulationen intrazellulärer Brownianer Diffusionsbahnen, die durch eine beliebige Zellgeometrie räumlich begrenzt sind. Basierend auf den simulierten Flugbahnen werden rohe Einzelmolekülbilder auf die gleiche Weise erzeugt und analysiert wie experimentelle Bilder. Auf diese Weise werden experimentelle Präzisions- und Genauigkeitseinschränkungen, die experimentell schwer zu kalibrieren sind, explizit in den Analyse-Workflow integriert. Der Diffusionskoeffizient und die relativen Bevölkerungsfraktionen der vorherrschenden diffusiven Zustände werden bestimmt, indem die Verteilungen der experimentellen Werte mithilfe linearer Kombinationen simulierter Verteilungen einzupassen sind. Wir demonstrieren den Nutzen unseres Protokolls, indem wir die diffusiven Zustände eines Proteins auflösen, das bei der Bildung von homo- und heterooligomeren Komplexen im Zytosol eines bakteriellen Erregers unterschiedliche diffusive Zustände aufweist.

Introduction

Die Untersuchung des diffusiven Verhaltens von Biomolekülen gibt Einblick in ihre biologischen Funktionen. Fluoreszenzmikroskopie-basierte Techniken sind zu wertvollen Werkzeugen für die Beobachtung von Biomolekülen in ihrer nativen Zellumgebung geworden. Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)1 bieten ensemble-gemittelte diffusive Verhaltensweisen. Umgekehrt ermöglicht die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie die Beobachtung einzelner fluoreszierend markierter Moleküle mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung2,3,4. Die Beobachtung einzelner Moleküle ist von Vorteil, da ein Protein von Interesse in verschiedenen diffusiven Zuständen existieren kann. Beispielsweise entstehen zwei leicht zu unterscheidende diffusive Zustände, wenn ein Transkriptionsregulator, wie CueR in Escherichia coli,frei im Zytosol diffundiert oder an eine DNA-Sequenz bindet und auf der Zeitskala der Messung immobilisiert wird5 . Ein-Molekül-Tracking bietet ein Werkzeug, um diese verschiedenen Zustände direkt zu beobachten, und anspruchsvolle Analysen sind nicht erforderlich, um sie zu lösen. Allerdings wird es schwieriger, mehrere diffusive Staaten und ihre Bevölkerungsfraktionen in Fällen zu lösen, in denen ihre diffusiven Raten ähnlicher sind. Aufgrund der Größenabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten manifestieren sich z. B. unterschiedliche Oligomerisierungszustände eines Proteins als verschiedene diffusive Zustände6,7,8,9 , 10. Solche Fälle erfordern einen integrierten Ansatz in Bezug auf Datenerfassung, -verarbeitung und -analyse.

Ein kritischer Faktor, der die diffusiven Raten von zytosolischen Molekülen beeinflusst, ist die Wirkung der Eingrenzung durch die Zellgrenze. Die Beschränkungen für die molekulare Bewegung durch eine bakterielle Zellgrenze führen dazu, dass die gemessene Diffusionsrate eines zytosolischen Moleküls langsamer erscheint, als wenn dieselbe Bewegung in einem nicht begrenzten Raum aufgetreten wäre. Bei sehr langsam diffundierenden Molekülen ist die Wirkung der zellulären Einschließung aufgrund fehlender Kollisionen mit der Grenze vernachlässigbar. In solchen Fällen kann es möglich sein, diffusive Zustände genau aufzulösen, indem die Verteilungen von molekularen Verschiebungen, roder scheinbaren Diffusionskoeffizienten, D*,mithilfe analytischer Modelle, die auf den Gleichungen für die Brownsche Bewegung basieren ( zufällige Diffusion)11,12,13. Für schnell diffundierende zytosolische Moleküle ähneln die experimentellen Verteilungen jedoch nicht mehr denen, die aufgrund von Kollisionen von diffundierenden Molekülen mit den Zellgrenzen für eine unbeschränkte Brownsche Bewegung erhalten wurden. Die Eingrenzungseffekte müssen berücksichtigt werden, um die nicht begrenzten Diffusionskoeffizienten der fluoreszierend markierten Moleküle genau zu bestimmen. In jüngster Zeit wurden mehrere Ansätze entwickelt, um Die eingrenzende Wirkung entweder (halb-)analytisch 5,14,15,16 oder numerisch durch Monte-Carlo-Simulationen von Braune Diffusion6,10,16,17,18,19.

Hier bieten wir ein integriertes Protokoll zum Sammeln und Analysieren von Single-Molekül-Lokalisierungsmikroskopiedaten mit besonderem Fokus auf Single-Molekül-Tracking. Das Endziel des Protokolls ist es, diffusive Zustände von fluoreszierend markierten zytosolischen Proteinen in diesem Fall stabförmigen Bakterienzellen aufzulösen. Unsere Arbeit baut auf einem früheren Protokoll zur Einzelmolekülverfolgung auf, in dem eine DNA-Polymerase, PolI, durch Diffusionsanalyse20in einem DNA-gebundenen und ungebundenen Zustand nachgewiesen wurde. Hier erweitern wir die Einzelmolekül-Tracking-Analyse auf 3D-Messungen und führen realistischere Rechensimulationen durch, um mehrere diffusive Zustände gleichzeitig in Zellen aufzulösen und zu quantifizieren. Die Daten werden mit einem selbst gebauten 3D-Superauflösungsfluoreszenzmikroskop erfasst, das in der Lage ist, die 3D-Position von Fluoreszenzstrahlern durch Bildgebung mit der Doppelhelix-Punkt-Spread-Funktion (DHPSF)21,22zu bestimmen. Die rohen Einzelmolekülbilder werden mit individueller Software verarbeitet, um die 3D-Einzelmolekül-Lokalisationen zu extrahieren, die dann zu Einmolekül-Trajektorien kombiniert werden. Tausende von Flugbahnen werden gebündelt, um Verteilungen von scheinbaren Diffusionskoeffizienten zu erzeugen. In einem letzten Schritt passen die experimentellen Verteilungen zu numerisch generierten Verteilungen, die durch Monte-Carlo-Simulationen der Brownschen Bewegung in einem begrenzten Volumen erhalten werden. Wir wenden dieses Protokoll an, um die diffusiven Zustände des Typ-3-Sekretionssystemproteins YscQ in lebenden Yersinia enterocoliticazu lösen. Aufgrund seines modularen Charakters ist unser Protokoll allgemein auf jede Art von Einzelmolekül- oder Einzelpartikel-Tracking-Experiment in beliebigen Zellgeometrien anwendbar.

Protocol

1. Doppelhelix Punkt-Spread-Funktionskalibrierung HINWEIS: Die in diesem und den folgenden Abschnitten beschriebenen Bilder werden mit einem kundenspezifischen invertierten Fluoreszenzmikroskop, wie in Rocha et al.23beschrieben, erstellt. Das gleiche Verfahren gilt für verschiedene Mikroskop-Implementierungen für die Ein-Molekül-Lokalisierung und Tracking-Mikroskopie2,3,4. All…

Representative Results

Unter den hier beschriebenen Experimentellen Bedingungen (20.000 Frames, Trajektollänge mindestens 4 Lokalisationen) und je nach Expressionsniveau der fluoreszierend markierten Fusionsproteine, ergeben ca. 200-3.000 Lokalisationen 10-150 Pro Zelle können Flugbahnen erzeugt werden (Abbildung 2a,b). Eine große Anzahl von Flugbahnen ist notwendig, um eine gut beprobte Verteilung der scheinbaren Diffusionskoeffizienten zu erzeugen. Die Größe…

Discussion

Ein entscheidender Faktor für die erfolgreiche Anwendung des vorgestellten Protokolls ist es, sicherzustellen, dass einmolekulare Signale gut voneinander getrennt sind (d.h. sie müssen räumlich und zeitlich spärlich sein (Ergänzende Mov. 1)). Wenn es mehr als ein Fluoreszenzmolekül in einer Zelle gleichzeitig gibt, dann könnte die Lokalisierung fälschlicherweise der Flugbahn eines anderen Moleküls zugeordnet werden. Dies wird als Verknüpfungsproblem30bezeichnet. Experime…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Alecia Achimovich und Ting Yan für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken Ed Hall, Senior Staff Scientist in der Advanced Research Computing Services Gruppe an der University of Virginia, für die Hilfe bei der Einrichtung der Optimierungsroutinen, die bei dieser Arbeit verwendet werden. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde von der University of Virginia bereitgestellt.

Materials

2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.
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Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).
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