Гомеозисные Локусов Focused ТРИФОСФАТЫ/sgRNA библиотека скрининга выявление критических CTCF границы

Недавние исследования взаимодействия генома показали, что форм ядерного генома человека стабильные топологически связывая доменов (ТЗЖ), которые сохраняются в различных видов и типов клеток. Организация генома в отдельные домены облегчает и ограничивает взаимодействие между регуляторных элементов (например, усилители и промоутеров). Коэффициент CCCTC-привязки (CTCF) связывается с TAD границ и играет решающую роль в ограничение взаимодействия элементов ДНК, которые находятся в соседних TADs¹. Однако, генома широкий CTCF привязки данных показал, что, хотя CTCF главным образом взаимодействует с же ДНК сайтов в различных типов клеток, он часто функционирует как хроматина барьер на определенном сайте в одну ячейку типа, но не в другом, предлагая что CTCF функции Вместе с другими мероприятиями в формировании хроматина границы². Что остается неизвестным является ли граничных элементов (CTCF-привязки сайтов) напрямую связаны с биологической функции CTCF, и как эти ссылки встречаются. Таким образом мы предполагаем, что конкретных сайтов связывания CTCF в геноме непосредственно регулировать образование TADs и промоутер/усилитель взаимодействия в рамках этих доменов или между соседними доменами. Завершение проектов секвенирования генома мыши и последующий анализ эпигеномные человека и обнаружили новых молекулярных и генетических подписей генома. Однако роль конкретных подписей/изменения в регулирование гена и клеточную функцию, а также их молекулярные механизмы, еще не в полной мере понять.

Несколько строк доказательства поддержки, что CTCF-опосредованной TADs представляют функциональные хроматина домены^3,4,5. Хотя CTCF главным образом взаимодействует с же ДНК сайтов в различных типов клеток, генома широкий CTCF чип seq данные показали, что CTCF часто действует как барьер хроматина в одной ячейке тип, но не в других². CTCF играет важную роль в процессе разработки путем посредничества генома организации^4,6,7. Нарушение границ CTCF нарушениями усилитель/промоутер взаимодействий и экспрессии генов, приводит к закупорке развития. Это свидетельствует о том, что CTCF при посредничестве TADs являются не только структурные компоненты, но и регулирования подразделений, необходимых для надлежащего enhancer действий и Джин транскрипции^5,8,9.

Гомеозисные гены играют решающую роль в ходе эмбрионального развития и они височно и пространственно ограничены в их шаблоны выражений. Локус HOXA образует два стабильных TADs разделения генов передней и задней границы CTCF-связанный элемент в ЭСК и IMR90 клетки¹. Последние доклады свидетельствуют, что HoxBlinc, HoxB lncRNA Локус связанные, опосредует формирования CTCF направлены TADs и усилитель/промоутер взаимодействий в локусе HOXB . Это приводит к передней HOXB генов активации во время ESC приверженность и дифференциации¹⁰. Кроме того в определенных генов локусов, включая HOXA локус, переоборудование CTCF опосредованной TAD доменов изменил линии конкретный ген выражение профили и был связан с развитием болезни государства^11,12. Доказательства поддерживает основную функцию CTCF в координации транскрипции гена и определения личности клетки путем организации генома в функциональных областях.

Несмотря на свою роль в развитии эмбриона, кроветворения HOX гены регулируют функции кроветворных стволовых и прогениторных клеток (HS/PC). Это делается путем контроля баланса между пролиферации и дифференцировки^10,13,14,15. Экспрессии Гомеозисных генов жестко регулируется в спецификации и дифференциации кроветворных клеток, с высшим выражением в HS / экспрессии шт. Гомеозисных генов постепенно уменьшается во время созревания, с ее низким уровнем происходящие в дифференцированной гемопоэтические клетки¹⁶. Регуляции генов HOX является доминирующей механизмом лейкозных трансформации свойствами самообновления и дифференциации dysregulating HS/ПК, ведущих к лейкозных преобразования^17,18. Однако механизм установления и поддержания нормальной против онкогенных выражение модели Гомеозисных генов, а также связанные с ними нормативных сети остается неясным.

ТРИФОСФАТЫ-Cas9 sgRNA библиотека скрининг широко использовался допросить белка кодирование генов¹⁹ как гены, также как не кодирования, например lncRNA²⁰ и Мирна²¹ в разных видов. Однако стоимость использования библиотеки ТРИФОСФАТЫ-Cas9 sgRNA для выявления новых геномных целей остается высокой, потому что высок объём генома часто применяется для проверки проверки библиотеки sgRNA. Наши sgRNA скрининг системы сосредоточена на конкретных генома локусов и оценивает таргетинга sgRNAs через Одношаговая RT-PCR согласно маркер экспрессии генов, например HOXA9. Кроме того Сэнгер, секвенирование подтвердил, что sgRNA была интегрирована в геноме и Indel мутации могут быть обнаружены для определения ориентации сайта sgRNA. Посредством конкретных локусов ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генетический скрининг, границы хроматина CBS7/9 была определена в качестве критического регулятор для создания домена онкогенных хроматина и поддержания внематочная HOX картин выражения гена в патогенезе бод ¹². метод может широко применяется для определения не только конкретные функции CTCF границы в эмбриональное развитие, кроветворения, leukemogenesis, но и CTCF границы как потенциальных терапевтических целей для будущих эпигеномные терапии.