HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

Estudios recientes de interacción genoma revelaron que las formas del genoma nuclear humano estable dominios topológicamente asociaba (TADs) que se conservan a través de especies y tipos celulares. La organización del genoma en dominios separados facilita y restringe las interacciones entre elementos reguladores (por ejemplo, promotores y potenciadores). El factor de Unión CCCTC (CTCF) se une a límites TAD y juega un papel fundamental en las interacciones vinculantes de elementos de ADN que se encuentran en el vecino TADs¹. Sin embargo, los datos de Unión CTCF amplia del genoma revelaron que aunque CTCF interactúa principalmente con los mismos sitios de ADN en diferentes tipos celulares, a menudo funciona como una barrera de la cromatina en un sitio específico en una celda tipo pero no en el otro, lo que sugiere que las funciones CTCF junto con otras actividades en la formación de cromatina límites². Lo que se desconoce es si los elementos de frontera (sitios de unión a CTCF) están directamente relacionados con la función biológica de CTCF y cómo se producen estos enlaces. Por lo tanto, presumimos que sitios específicos de unión de CTCF en el genoma directamente regulan la formación de TADs y controlan las interacciones promotor/enhancer dentro de estos dominios o entre los dominios vecinos. La terminación de los humanos y proyectos de secuenciación de genoma de ratón y posterior análisis epigenéticos han descubierto nuevas firmas moleculares y genéticas del genoma. Sin embargo, el papel de las firmas/modificaciones específicas en la regulación de genes y función celular, así como sus mecanismos moleculares, han de entenderse completamente.

Múltiples líneas de evidencia apoyan que el TADs CTCF-mediada representa cromatina funcional de dominios^3,4,5. Aunque CTCF interactúa principalmente con los mismos sitios de ADN en diferentes tipos celulares, datos del CTCF ChIP-seq amplia genoma revelaron que CTCF a menudo funciona como una barrera de cromatina en tipo de una célula pero no en los otros². CTCF juega un papel esencial durante el desarrollo por mediación de genoma organización^4,6,7. Alteración de límites CTCF deteriorado interacciones reforzador/promotor y expresión génica, llevando a la obstrucción del desarrollo. Esto sugiere que el CTCF mediado TADs no sólo son componentes estructurales, sino también unidades regulatorias necesarias para reforzador adecuado acción y gene transcripción^5,8,9.

Genes HOX desempeñan papeles importantes durante el desarrollo embrionario y se limitan temporal y espacial en sus patrones de expresión. El locus HOXA forma dos TADs estables separación de genes anteriores y posteriores, por un elemento límite asociado de CTCF en hESCs y IMR90 las células¹. Informes recientes demuestran que HoxBlinc, un HoxB locus asociado lncRNA, interviene en la formación de CTCF dirigido TADs e interacciones reforzador/promotor en el locus HOXB . Esto conduce a la activación de gen HOXB anterior durante el compromiso y la diferenciación de ESC¹⁰. Además, en lugares geométricos del gene específicos incluyendo el lugar geométrico HOXA , alteración de CTCF mediada por perfiles de expresión de gen específico de linaje TAD dominios cambiados y se asoció con el desarrollo de la enfermedad los Estados^11,12. La evidencia apoya una función primaria de CTCF en coordinación de transcripción genética y determinar la identidad de la célula mediante la organización del genoma en dominios funcionales.

A pesar de su papel en el desarrollo embrionario, durante la hematopoyesis, genes HOX regulan función hematopoyética de la célula (capítulo/PC) del vástago y del progenitor. Esto se hace controlando el equilibrio entre la proliferación y diferenciación^10,13,14,15. La expresión de genes HOX se regula firmemente a lo largo de la especificación y diferenciación de células hematopoyéticas, con la más alta expresión en HS / Uds. HOX genes disminuyen gradualmente durante la maduración, con sus niveles más bajos que ocurre en había distinguido células hematopoyéticas¹⁶. Dysregulation del gene HOX es un mecanismo dominante de la transformación leucémica por propiedades de auto renovación y diferenciación de dysregulating de HS/PCs a transformación leucémica^17,18. Sin embargo, el mecanismo de establecer y mantener normal frente a patrones de la expresión oncogénica de genes HOX como redes de regulación asociadas sigue siendo confuso.

Proyección de biblioteca CRISPR Cas9 sgRNA ha sido ampliamente utilizado para interrogar la proteína-codificación genes¹⁹ como bien como no codificantes de genes, como lncRNA²⁰ y miRNA²¹ en diferentes especies. Sin embargo, el costo de usar la biblioteca de sgRNA CRISPR Cas9 para identificar nuevas dianas genómicas sigue siendo alto, porque la secuencia del genoma de alto rendimiento se aplica a menudo para comprobar la proyección de la biblioteca de sgRNA. Nuestro sgRNA sistema se centra en los loci del genoma específicas y evalúa los objetivos sgRNAs a través de RT-PCR de un paso según la expresión del gen marcador, como HOXA9. Además, puede detectarse Sanger secuenciación confirmó que los sgRNA fue integrado en el genoma y las mutaciones Indel identificar lo sgRNA a sitio. A través de la investigación genética de CRISPR Cas9 loci específicos, el límite de la cromatina CBS7/9 ha sido identificado como un regulador crítico para establecer dominio de cromatina oncogénico y mantener patrones de expresión de gene HOX ectópicos en patogenesia AML ¹². el método puede ser ampliamente aplicado para identificar no sólo la función específica de límite de CTCF en desarrollo embrionario, la hematopoyesis, leukemogenesis, pero también límite CTCF como potenciales dianas terapéuticas para la futura terapia epigenética.