HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリ スクリーニングを識別する重要な CTCF の境界
Summary
CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA ライブラリをについて説明します。
Abstract
CCCTC 結合因子 (CTCF)-仲介された安定した位相ドメインを関連付ける (TADs) 近隣 TADs のある DNA 要素の制約の相互作用で重要な役割を果たします。CTCF は、胚や体のパターン形成、造血、白血病を制御するHOX遺伝子発現の時空の調節に重要な役割を果たしています。しかし、それはHOX遺伝子の関連付けられている CTCF 境界クロマチン構造およびHOXの遺伝子発現を調節する方法かどうか、主として未知に残る。現在のプロトコルで少し形成とHOX遺伝子のクロマチンの CTCF 関連付けられた境界を中断することの効果を検討するHOXA/B/C/D座すべて CTCF 結合部位をターゲット特定 sgRNA プールされたライブラリが生成されました。式です。CRISPR Cas9 を介して遺伝学的スクリーニング、 HOXA7/HOXA9遺伝子 (CBS7/9) の間にある CTCF 結合部位は、 HOX遺伝子の異所性の維持のために重要であることと同様、発癌性クロマチン ドメインの重要な調節因子として同定されています。MLL 再配置の急性骨髄性白血病 (AML) の発現パターン。したがって、スクリーニングのアプローチこの sgRNA ライブラリの特定遺伝子座における媒介 CTCF ゲノム構成に新しい洞察力を提供し、また両方のコーディング、注釈付きの遺伝的規制要素の機能特性の基礎を提供し、ポスト人間ゲノム プロジェクト時代の正常な生物学的プロセスの間に、非翻訳。
Introduction
最近のゲノムの相互作用の研究では、細胞の種類と種の間で保存されているトポロジとして関連付けるドメイン (TADs) を人間の核ゲノム フォームに安定を明らかにしました。ゲノムの組織を別ドメインは容易、規制要素 (例えば、エンハンサーやプロモーター) 間の相互作用を制限します。CCCTC 結合因子 (CTCF) 少しの境界に、近隣 TADs1である DNA 要素の制約の相互作用に重要な役割を果たしています。ただし、ゲノム広い CTCF のデータ バインディングは、CTCF とほとんど同じ DNA サイトを異なる種類の細胞でやり取りが多くの場合として機能する他の示唆ではなく 1 つのセル型で特定のサイトでのクロマチン障壁を明らかにしたその CTCF 関数クロマチンの境界2の形成の他の活動。かどうか境界要素 (CTCF 結合部位) に直結する、CTCF の生物学的機能と、これらのリンクが発生する方法は不明のまま。したがって、我々 はゲノムの特定の CTCF 結合サイトは直接 TADs の形成を調節して制御プロモーター/エンハンサー相互作用ドメイン内または隣接ドメイン間と仮定します。人間とマウスのゲノム プロジェクト以降のエピジェネティクス解析の完了は、ゲノムの分子および遺伝の新しい署名を発見されています。しかし、遺伝子細胞の機能とその分子機構、特定の署名/変更の役割はまだ完全に理解するのにあります。
証拠の複数のラインをサポート CTCF を介した TADs はクロマチン機能ドメイン3,4,5を表します。CTCF とほとんど同じ DNA サイトを異なる種類の細胞でやり取り、ゲノム広い CTCF チップ seq データが判明 CTCF しばしば他の2ではなく 1 つのセル型でクロマチン バリアとして機能しています。CTCF はゲノム組織4,6,7を仲介することにより開発時に重要な役割を果たしています。CTCF 境界の中断障害エンハンサー/プロモーターの相互作用および遺伝子発現、発達的閉塞に 。TADs を CTCF に関与が示唆された構造のコンポーネントだけでなく、適切なエンハンサー アクションと遺伝子転写5,8,9に必要な規制の単位が。
HOX遺伝子は萌芽期の開発の間に重要な役割を果たす、彼らが時間的、空間的制限されてその発現パターン。HOXA軌跡 hESCs と IMR90 セル1の CTCF 関連付けられた境界要素で前部と後部の遺伝子を分離する 2 つの安定した TADs を形成します。最近のレポートは示したHoxBlinc、 HoxB軌跡関連付けられている lncRNA が CTCF の形成を仲介する TADs およびHOXB軌跡のプロモーター/エンハンサー相互作用を監督します。これは ESC のコミットメントと分化の10の間に前部HOXB遺伝子の活性化に します。さらに、 HOXAの軌跡を含む特定の遺伝子座、CTCF の変質は少しドメイン変更系統特異的遺伝子発現プロファイルを介したし、疾患状態11,12の開発に関連付けられていた。証拠は、遺伝子転写の調整と機能ドメインにゲノムを組織することによって細胞のアイデンティティを決定する CTCF の主な機能をサポートします。
HOX遺伝子は, 造血巣の中に萌芽期の開発に於いての役割にもかかわらず造血幹・前駆細胞 (HS/PC) の機能を調節します。これは、増殖・分化10,13,14,15の間のバランスを制御することによって行われます。HOX遺伝子の発現が仕様と HS の最高の表現で、造血細胞の分化の中で堅く調整される pc HOX遺伝子発現は徐々 にその最も低いレベルの成熟に伴う減少/造血細胞16を区別で発生しています。HOX遺伝子の調節不全は、HS/pc 白血病変換17,18につながる dysregulating の自己複製と分化プロパティによる白血病変換の支配的なメカニズムです。ただし、確立と関連規制の網と同様、 HOX遺伝子の発癌性発現パターンと通常を維持のメカニズムは不明のまま。
CRISPR Cas9 sgRNA ライブラリ スクリーニングは、lncRNA20 miRNA21種なども、非コーディングの遺伝子と蛋白質のコーディングの遺伝子19を尋問する広く使用されています。ただし、新しいゲノム標的を識別する CRISPR Cas9 sgRNA ライブラリを使用するためのコストは、高スループット ゲノム sgRNA ライブラリ スクリーニングに応用する頻繁ので高、まま。スクリーニング システム私たちの sgRNA は特定ゲノム遺伝子に焦点を当てたし、 HOXA9などのマーカー遺伝子の発現によるとワンステップ RT-PCR をターゲット sgRNAs を評価します。さらに、サイトをターゲット sgRNA を識別するためにサンガー シーケンス確認、sgRNA はゲノムと塩基変異に統合されたことを検出できます。軌跡固有 CRISPR Cas9 の遺伝学的スクリーニングを通じて CBS7/9 クロマチン境界は発癌性クロマチン ドメインを確立し、急性骨髄性白血病の病因における異所性のHOX遺伝子の発現パターンを維持するための重要な調節因子として同定されています。12. メソッドは、将来のエピジェネティック療法の潜在的な治療上のターゲットとして CTCF 萌芽期の開発、造血、白血病がまた CTCF 境界の境界だけでなく特定の機能を識別するために広く適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛋白質コーディングの遺伝子は、遺伝子と sgRNA 濃縮24,25,26 を通じて特定の細胞機能を調節するネットワークを識別するための機能的スクリーニング システム sgRNA ライブラリを適用されている関連、27,28。いくつかの非コーディングの地域関連 sgRNA ライブラリは、また?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はまた原稿を編集のニコラス セザーリを感謝します。仕事は、国立衛生研究所 (s. h.、R01DK110108、R01CA204044) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
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