HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini

Recenti studi di interazione tra genoma ha rivelato che le forme di genoma nucleare stabili topologicamente associando domini (TADs) che sono conservati attraverso specie e tipi di cellule. L’organizzazione del genoma in domini distinti facilita e limita le interazioni tra elementi normativi (ad es., esaltatori e promotori). Il fattore di CCCTC-associazione (CTCF) si lega ai limiti di TAD e svolge un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs¹. Tuttavia, il genoma vasta CTCF associazione dati hanno rivelato che sebbene CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi cellulari, spesso funziona come una barriera di cromatina presso un sito specifico in una cella tipo ma non in altro, suggerendo che funzioni CTCF insieme ad altre attività nella formazione della cromatina confini². Ciò che rimane sconosciuto è se gli elementi di contorno (siti di legame per CTCF) sono direttamente collegati alla funzione biologica di CTCF, e come questi collegamenti si verificano. Quindi, supponiamo che specifici siti di legame di CTCF nel genoma direttamente regolano la formazione di TADs e controllano le interazioni promoter/enhancer all’interno di questi domini o tra domini limitrofi. Il completamento dei umani e successive analisi epigenetiche e progetti di sequenziamento del genoma di topo hanno scoperto nuove firme genetiche e molecolari del genoma. Tuttavia, il ruolo di firme/modifiche specifiche nella regolazione genica e la funzione cellulare, come pure i loro meccanismi molecolari, devono ancora essere pienamente compreso.

Linee multiple di prova sostengono che il TADs CTCF-mediata rappresenta funzionale della cromatina domini^3,4,5. Anche se CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi cellulari, dati CTCF ChIP-seq ampi del genoma ha rivelato che CTCF spesso funziona come una barriera di cromatina in una cella tipo ma non negli altri². CTCF svolge un ruolo essenziale durante lo sviluppo di mediazione genoma organizzazione^4,6,7. Rottura dei confini CTCF alterata enhancer/promotore interazioni ed espressione genica, che conduce al bloccaggio inerente allo sviluppo. Ciò suggerisce che CTCF mediata TADs sono non solo componenti strutturali, ma anche unità normativo necessario per enhancer corretta azione e gene trascrizione^5,8,9.

Geni HOX giocano un ruolo critico nello sviluppo embrionale e sono temporalmente e spazialmente limitate nel loro pattern di espressione. Il locus HOXA forma due TADs stabile che separa geni anteriori e posteriori da un elemento di contorno CTCF-collegata in hESCs e IMR90 cellule¹. I rapporti recenti hanno dimostrato che HoxBlinc, un HoxB locus associato lncRNA, media la formazione di CTCF diretto TADs e interazioni enhancer/promotore in luogo del HOXB . Questo porta alla attivazione del gene HOXB anteriore durante ESC impegno e differenziazione¹⁰. Inoltre, ai loci genici specifici compreso il luogo HOXA , alterazione di CTCF mediata profili di espressione genica specifici di TAD domini ha cambiato la sua stirpe ed è stata associata con lo sviluppo della malattia stati^11,12. La prova sostiene una funzione primaria per CTCF nella trascrizione genica di coordinamento e nella determinazione della microcella organizzando il genoma in domini funzionali.

Nonostante il suo ruolo nello sviluppo embrionale, durante l’ematopoiesi, geni HOX regolano la funzione delle cellule (HS/PC) ematopoietica staminali e progenitrici. Questo viene fatto controllando l’equilibrio tra proliferazione e differenziazione^10,13,14,15. L’espressione dei geni HOX è strettamente regolata in tutta la specifica e la differenziazione delle cellule ematopoietiche, con massima espressione in HS / espressione genica pz. HOX gradualmente diminuisce durante la maturazione, con i suoi livelli più bassi che si verificano differenziato cellule ematopoietiche¹⁶. Disregolazione genica HOX è un meccanismo dominante di trasformazione leucemica di proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione disregolando di HS/PCs che conduce alla trasformazione leucemica^17,18. Tuttavia, il meccanismo di stabilire e mantenere la normale vs modelli di espressione oncogena di geni HOX , nonché reti di regolazione associati rimane poco chiaro.

Lo screening CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteca è stato ampiamente usato per interrogare di geni codificanti per proteine¹⁹ come bene come geni non codificanti, come lncRNA²⁰ e miRNA²¹ in specie diverse. Tuttavia, il costo per utilizzare la libreria di sgRNA CRISPR-Cas9 per identificare nuovi bersagli genomici rimane alto, perché il sequenziamento del genoma ad alta velocità è spesso applicato per verificare la proiezione di libreria sgRNA. Nostro sgRNA sistema di screening è focalizzata sul loci specifici genoma e valuta la sgRNAs targeting attraverso One-step RT-PCR secondo l’espressione del gene marcatore, ad esempio HOXA9. Inoltre, Sanger sequenziamento ha confermato che il sgRNA è stato integrato nel genoma le mutazioni Indel può essere rilevata per identificare il sgRNA targeting per sito. Attraverso lo screening genetico loci specifici CRISPR-Cas9, il confine di cromatina CBS7/9 è stato identificato come un regolatore fondamentale per stabilire il dominio della cromatina oncogeno e mantenere ectopico pattern di espressione genica HOX nella patogenesi dell’AML ¹². il metodo può essere ampiamente applicato per identificare non solo la funzione specifica di confine CTCF in sviluppo embrionale, ematopoiesi, leukemogenesis, ma anche limite di CTCF come potenziali bersagli terapeutici per la futura terapia epigenetica.