HOX Loci gericht CRISPR/sgRNA bibliotheek Screening identificeren kritische CTCF grenzen

Recente genoom interactie onderzoek uitgewezen dat het menselijk genoom van de nucleaire vormen stabiele topologisch associëren domeinen (TADs) die zijn bewaard in de celtypen en soorten. De organisatie van het genoom in aparte domeinen vergemakkelijkt en interacties tussen regelgevende elementen (bijvoorbeeld versterkers en initiatiefnemers) beperkt. De CCCTC-bindende factor (CTCF) bindt aan TAD grenzen en speelt een cruciale rol in beperkende interacties van DNA-elementen die zich in aangrenzende TADs^{1 bevinden}. Echter, genoom-brede CTCF bindende gegevens bleek dat hoewel CTCF meestal met dezelfde DNA-sites in verschillende celtypen communiceert, het vaak als een barrière van de chromatine op een specifieke site in één celtype maar niet in de andere fungeert, wat suggereert dat CTCF-functies samen met andere activiteiten in de vorming van chromatine grenzen². Wat blijft onbekend is of de grens elementen (CTCF-bandplaatsen) rechtstreeks gekoppeld zijn aan de biologische functie van CTCF, en hoe deze koppelingen optreden. We veronderstellen daarom dat specifieke CTCF bandplaatsen in het genoom direct de vorming van TADs regelen en promotor/versterker interacties binnen deze domeinen of tussen naburige domeinen. De voltooiing van de mens en de muis genoom sequencing projecten en de daaropvolgende epigenetische analyses hebben ontdekt nieuwe moleculaire en genetische handtekeningen van het genoom. De rol van specifieke handtekeningen/wijzigingen in genexpressie en cellulaire functie, evenals hun moleculaire mechanism(s), moeten echter nog volledig worden begrepen.

Meerdere lijnen van bewijsmateriaal ondersteunen dat de CTCF-gemedieerde TADs functionele chromatine domeinen^{3,4,5 vertegenwoordigen} Hoewel CTCF meestal met dezelfde DNA-sites in verschillende celtypen communiceert, bleek genoom-brede CTCF ChIP-seq gegevens dat de CTCF vaak als een barrière van de chromatine in één celtype maar niet in de andere^{2 fungeert}. CTCF speelt een essentiële rol tijdens de ontwikkeling door het genoom organisatie^4,6,7te bemiddelen. Verstoring van de CTCF grenzen verminderde versterker/promotor interacties en genexpressie, leidt tot ontwikkelingsstoornissen verstopping. Dit suggereert dat CTCF TADs gemedieerde zijn niet alleen de structurele onderdelen, maar ook de regelgevende eenheden vereist voor een juiste versterker actie en gene transcriptie^5,8,9.

HOX -genen spelen een kritieke rol tijdens de embryonale ontwikkeling en ze zijn stoffelijk als ruimtelijk beperkt in hun expressiepatronen. De locus HOXA vormt twee stabiele TADs anterior en posterior genen te scheiden door een element van de CTCF-geassocieerde grens in zowel hESCs als IMR90 cellen¹. Uit recente rapporten blijkt dat HoxBlinc, een HoxB verbonden locus lncRNA, de vorming van CTCF bemiddelt geregisseerd TADs en versterker/promotor-interacties in de locus HOXB . Dit leidt tot anterior HOXB gene activering tijdens ESC inzet en differentiatie¹⁰. Anderzijds op specifiek gen loci met inbegrip van het HOXA locus, wijziging van de CTCF gemedieerde TAD domeinen veranderd lineage specifiek gen expressieprofielen en werd geassocieerd met de ontwikkeling van ziekte staten^11,12. Het bewijs ondersteunt een primaire functie voor CTCF in coördinatie van de transcriptie van het gen en het bepalen van de cel identiteit door het organiseren van het genoom in functionele domeinen.

Ondanks haar rol in de ontwikkeling van het embryo, tijdens Haematopoiese, reguleren HOX -genen hematopoietische stamcellen en voorlopercellen functie van de cel (HS/PC). Dit wordt gedaan door het beheersen van het evenwicht tussen de proliferatie en differentiatie^10,13,14,15. De expressie van HOX -genen is strak geregeld gedurende de specificatie en de differentiatie van hematopoietische cellen, met de hoogste expressie in HS / PCs. HOX genexpressie daalt geleidelijk tijdens de rijping, met het laagste niveau die zich in gedifferentieerde hematopoietische cellen¹⁶. HOX gene disregulatie is een dominante mechanisme van leukemische transformatie door dysregulating eigenschappen van de zelf-vernieuwing en differentiatie van HS/PCs leidt tot leukemische transformatie^17,18. Het mechanisme van het opzetten en onderhouden van de normale vs. oncogene expressiepatronen van HOX -genen, alsmede bijbehorende regulerende netwerken blijft echter onduidelijk.

CRISPR-Cas9 sgRNA bibliotheek screening is wijd verbeid gebruikt om te ondervragen van eiwit-codeert genen¹⁹ als ook als niet-codeert genen, zoals lncRNA²⁰ en miRNA²¹ in verschillende soorten. De kosten voor het gebruik van de CRISPR-Cas9-sgRNA-bibliotheek te identificeren van nieuwe genomic doelstellingen blijft echter hoog, omdat high-throughput genoom sequencing vaak toegepast wordt om te controleren of de sgRNA bibliotheek screening. Onze sgRNA screening systeem is gericht op de specifieke genoom loci en resulteert in de targeting sgRNAs via one-step RT-PCR volgens de genexpressie markering, zoals HOXA9. Bovendien kan Sanger sequencing bevestigd dat de sgRNA werd geïntegreerd in het genoom, en Indel mutaties worden gedetecteerd om te identificeren van de sgRNA dat targeting site. Via de loci-specifieke CRISPR-Cas9 genetische screening, is de grens van de chromatine CBS7/9 geïdentificeerd als een kritische regulator voor totstandbrenging oncogene chromatine domein en het onderhoud van ectopische HOX gen expressiepatronen in AML pathogenese ¹². de methode kan algemeen worden toegepast om te identificeren niet alleen specifieke functie van de CTCF grens in de embryonale ontwikkeling, Haematopoiese, leukemogenesis, maar ook CTCF grens als therapeutisch doelwit voor toekomstige Epigenetische therapie.