HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites

Recentes estudos de interacção do genoma revelaram que os formulários do genoma nuclear humano estável domínios topologicamente associados (TADs) que são conservados entre as espécies e tipos de células. A organização do genoma em domínios separados facilita e restringe as interações entre elementos reguladores (por exemplo, potenciadores e promotores). O fator de ligação CCCTC (CTCF) liga-se aos limites do TAD e desempenha um papel crítico na restrição de interações de elementos de DNA que estão localizados na vizinha TADs¹. Dados de vinculação CTCF amplo do genoma revelaram, no entanto, que embora CTCF principalmente interage com os mesmos DNA-sites em diferentes tipos de células, muitas vezes funciona como uma barreira de cromatina em um site específico no tipo de uma célula, mas não na outra, sugerindo que funções do CTCF juntamente com outras atividades na formação de cromatina limites². O que permanece desconhecido é se os elementos de contorno (sites de ligação CTCF) estão directamente relacionados com a função biológica do CTCF e como ocorrem esses links. Portanto, nós hypothesize que sítios específicos de ligação CTCF no genoma diretamente regulam a formação de TADs e controlam interações promotor/realçador dentro desses domínios ou entre domínios vizinhos. A conclusão dos humanos e projetos de sequenciamento do genoma do rato e subsequentes análises epigenéticas ter descoberto novas assinaturas genéticas e moleculares do genoma. No entanto, o papel de assinaturas/modificações específicas na regulação gênica e função celular, bem como seu mecanismo molecular (s), ainda tem que ser completamente compreendido.

Várias linhas de evidência suportam que o TADs CTCF-mediada representam cromatina funcional domínios^3,4,5. Embora CTCF principalmente interage com os mesmos DNA-sites em diferentes tipos de células, genoma ampla CTCF ChIP-seq dados revelaram que CTCF muitas vezes funciona como uma barreira de cromatina no tipo de uma célula, mas não em outros². CTCF desempenha um papel essencial durante o desenvolvimento mediando genoma organização^4,6,7. Rompimento de limites CTCF prejudicada interações realçador/promotor e expressão do gene, levando à obstrução do desenvolvimento. Isto sugere que a CTCF mediada TADs não são apenas componentes estruturais, mas também unidades regulamentares necessárias para o adequado potenciador ação e gene transcrição^5,8,9.

Genes HOX desempenham papéis críticos durante o desenvolvimento embrionário, e eles são temporalmente e espacialmente restritas em seus padrões de expressão. O locus HOXA forma dois TADs estáveis separando genes anteriores e posteriores por um elemento de limite CTCF-associado em hESCs e IMR90 as células¹. Relatórios recentes demonstraram que o HoxBlinc, um lncRNA de locus associado HoxB , Medeia a formação do CTCF dirigido Tad e interações realçador/promotor no locus HOXB . Isto leva à ativação do gene HOXB anterior durante ESC compromisso e diferenciação¹⁰. Além disso, em loci de genes específicos incluindo o locus HOXA , alteração do CTCF mediada TAD domínios mudados linhagem perfis de expressão de genes específicos e foi associada com o desenvolvimento da doença Estados^11,12. A evidência suporta uma função primária para CTCF na coordenação da transcrição do gene e determinar a identidade da célula organizando o genoma em domínios funcionais.

Apesar de seu papel no desenvolvimento embrionário, durante a hematopoiese, genes HOX regulam a função de célula (HS/PC) de haste e progenitoras hematopoiética. Isso é feito controlando o equilíbrio entre a proliferação e diferenciação de^10,13,14,15. A expressão dos genes HOX é fortemente regulamentada em toda a especificação e a diferenciação das células hematopoiéticas, com maior expressão em HS / PCs. HOX expressao diminui gradualmente durante o amadurecimento, com seus níveis mais baixos ocorrendo em diferenciados de células hematopoiéticas¹⁶. Desregulagem do gene HOX é um mecanismo dominante das transformações leucêmicas por propriedades de auto-renovação e diferenciação de dysregulating levando a transformação leucêmicas^17,18HS/PCs. No entanto, o mecanismo de estabelecimento e manutenção normal vs padrões de expressão oncogênica de genes HOX , bem como redes de regulação associadas permanece obscuro.

Rastreio de biblioteca CRISPR-Cas9 sgRNA tem sido amplamente utilizado para interrogar de genes codificantes de proteínas¹⁹ como genes bem como não-codificantes, como²⁰ e miRNA lncRNA²¹ em diferentes espécies. No entanto, o custo para usar a biblioteca de sgRNA CRISPR-Cas9 para identificar novos alvos genômicos permanece elevado, porque o sequenciamento do genoma do elevado-throughput é muitas vezes aplicado para verificar o rastreio de biblioteca de sgRNA. Nosso sistema de rastreio de sgRNA está focada em locus específico do genoma e avalia o direcionamento sgRNAs através de uma etapa de RT-PCR de acordo com a expressão de gene marcador, como HOXA9. Além disso, Sanger sequenciamento confirmou que o sgRNA foi integrado no genoma e mutações Indel pode ser detectado para identificar o sgRNA segmentação local. Através do rastreio genético do CRISPR-Cas9 locus específico, o limite de cromatina de CBS7/9 foi identificado como um regulador fundamental para estabelecer o domínio de cromatina oncogênicos e manter padrões de expressão de gene HOX ectópica na patogênese da LMA ¹². o método pode ser amplamente aplicado para identificar não somente a função específica de limite CTCF no desenvolvimento embrionário, a hematopoiese, leukemogenesis, mas também limite CTCF como alvos terapêuticos para futura terapia epigenética.