Использование Elegans Caenorhabditis для изучения транс- и мульти-поколения эффекты токсичных веществ
Summary
Транс- и несколько поколений воздействие стойких химических веществ имеют важное значение для оценки их долгосрочных последствий в окружающей среде и для здоровья человека. Мы предоставляем новые подробные методы для изучения транс- и нескольких поколений эффекты с использованием свободного проживания nematode Caenorhabditis elegans.
Abstract
Информация о токсичности химических веществ имеет важное значение в их применении и обращении с отходами. Для химических веществ при низких концентрациях долгосрочные последствия имеют очень важное значение для оценки их последствий в окружающей среде и для здоровья человека. Демонстрируя долгосрочное влияние, воздействие химических веществ на протяжении поколений в последних исследованиях дают новое понимание. Здесь мы описываем протоколы для изучения воздействия химических веществ в течение нескольких поколений с помощью свободного проживания nematode Caenorhabditis elegans. Представлены два аспекта: (1) транс-поколения (TG) и (2) нескольких поколений эффект исследований, последний из которых отделен от нескольких поколений воздействия (MGE) и нескольких поколений остаточного (MGR) исследования эффекта. Исследование эффекта TG является надежным с простой целью определить, может ли химическое воздействие на родителей привести к каким-либо остаточным последствиям для потомства. После того, как эффекты измеряются на родителей, гипохлорит натрия решения используются, чтобы убить родителей и сохранить потомство, с тем чтобы облегчить измерение эффекта на потомство. Исследование эффекта TG используется для определения того, страдают ли потомство, когда их родитель подвергается воздействию загрязняющих веществ. Исследование эффекта MGE и MGR систематически используется для определения того, может ли непрерывное воздействие поколений привести к адаптивной реакции у потомства на протяжении поколений. Тщательный пикап и передача используются для различения поколений для облегчения измерения эффекта на каждое поколение. Мы также объединили протоколы для измерения поведения движения, воспроизводства, продолжительности жизни, биохимических и изменений экспрессии генов. Некоторые примеры экспериментов также представлены, чтобы проиллюстрировать транс- и нескольких поколений эффект исследований.
Introduction
Применение и утилизация отходов химических веществ в значительной степени зависит от информации об их воздействии в определенных концентрациях. Примечательно, что время является еще одним важным элементом между эффектами и концентрациями. То есть, химических веществ, особенно при низких концентрациях в реальной среде, нужно время, чтобы спровоцировать измеримые эффекты1. Поэтому исследователи устраивают разную продолжительность экспозиции в экспериментах на животных и даже охватывают весь жизненный цикл. Например, мыши подвергались воздействию никотина в течение 30, 90 или 180 дней для изучения его токсического воздействия 2. Тем не менее, продолжительность такого воздействия по-прежнему недостаточно для выяснения долгосрочных последствий загрязняющих веществ (например, стойких органических загрязнителей), которые могут длиться более поколений организмов в окружающей среде. Поэтому исследования воздействия на протяжении поколений приобретают все больше ею все больше внимания.
Есть два основных аспекта в исследованиях эффекта поколений. Первый из них является транс-поколения (TG) эффект исследования, которые могут надежно проверить ли химическое воздействие на родителей может привести к каким-либо последствиям для потомства3. Второе исследование представляет собой исследование эффекта нескольких поколений, которое носит более систематический характер с учетом как воздействия, так и остаточного воздействия. С одной стороны, эффекты воздействия нескольких поколений (MGE) используются для иллюстрации адаптивных реакций животных на долгосрочные сложные условия. С другой стороны, эффекты остатков нескольких поколений (MGR) используются для демонстрации долгосрочных остаточных последствий после воздействия, так как воздействие матери сопровождается воздействием эмбриона на первое потомство и воздействием зародышевой линии потомство, которое делает третье потомство, как первое поколение полностью из экспозиции4.
Хотя млекопитающие (например, мыши) являются модельорганизмов в исследованиях токсичности, особенно в отношении человека, их применение в изучении эффектов поколений является довольно трудоемким, дорогим и этически относительно 5. Соответственно, организмы, включая ракообразных Дафния Магна6, насекомое Drosophila melanogaster7 и зебрафиш Данио Рерио8, обеспечить альтернативный выбор. Тем не менее, эти организмы либо не имеют сходства с людьми, или требуют специального оборудования в исследованиях.
Caenorhabditis elegans – это небольшой свободно живущий нематод (примерно 1 мм в длину) с коротким жизненным циклом (примерно 84 ч при 20 градусах По кв.)9. Этот нематод разделяет многие биологические пути консервативныки для человека, и поэтому он был широко используется, чтобы проиллюстрировать последствия различных стрессов или токсикантов10. Примечательно, что 99,5% нематод являются гермафродитами, что делает эти организмы чрезвычайно подходящими для изучения эффектов поколений, например, TG эффекты тяжелых металлов и сульфонамидов3,11, MGE эффекты золотых наночастиц и тяжелых металлы12 и температура13, MGR эффекты сульфонамида14, и как MGE и MGR эффекты гамма облучения15 и линдан4. Кроме того, были найдены сопоставимые результаты между воздействием химических веществ (например, зеарабенана) на развитие и размножение мышей и C. elegans16,17, что обеспечило бы преимущество экстраполировать эффекты от этого маленького животного к человеку.
Оба TG и MG эффект исследований являются трудоемкими и нуждаются в тщательной конструкции и производительности. Примечательно, что в вышеупомянутых исследованиях существуют различия в выборе жизненных этапов, условиях воздействия и методах разделения поколений. Такие различия препятствуют прямому сопоставлению результатов и препятствуют дальнейшему толкованию результатов. Поэтому крайне важно установить единые протоколы для проведения исследований эффектов ТГ и МГ, а также обеспечить более широкую картину для выявления аналогичных моделей различных токсикантов или загрязняющих веществ в долгосрочных последствиях. Над целью настоящих протоколов продемонстрирует ясные процессы деятельности в изучении trans- и multi-generational влияния с C. elegans. Протоколы принесут пользу исследователям, которые заинтересованы в изучении долгосрочных последствий токсикантов или загрязняющих веществ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для успешного выполнения описанного протокола следует принять во внимание следующие предложения. Выполняйте общие экспериментальные операции в стерильной среде. Неправильная эксплуатация может привести к загрязнению штаммов кишечной палочки, например, грибков и клещев может п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
References
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
- Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
- Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
- Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
- Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
- Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
- Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
- Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
- Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
- Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
- Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
- Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
- Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
- Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
- Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
- Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
- Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
- Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
- Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).
