השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות
Summary
השפעות טרנס ומרובות הדורות של כימיקלים מתמידים הם חיוניים לשפוט את ההשלכות לטווח הארוך שלהם בסביבה ועל בריאות האדם. אנו מספקים שיטות מפורטות הרומן ללמוד טרנס ואפקטים רב הדורי באמצעות בעלי חיים בחינם ה, האלקאנס.
Abstract
מידע על רעילות של כימיקלים הם חיוניים ביישום שלהם וניהול פסולת. עבור כימיקלים בריכוזים נמוכים, ההשפעות ארוכות הטווח חשובות מאוד לשפוט את תוצאותיה בסביבה ועל בריאות האדם. במהלך הפגנת השפעות ארוכות טווח, השפעות של כימיקלים לאורך דורות במחקרים שנעשו לאחרונה מספקים תובנה חדשה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור לימוד השפעות של כימיקלים על פני מספר רב של דורות באמצעות שימוש חופשי לחיות באוטרוהאבאנגדיטיס. שני היבטים מוצגים: (1) טרנס-דורי (TG) ו-(2) מחקרי אפקט רב-דורי, האחרון שהוא מופרד לחשיפה רב-דורי (MGE) וללימודי אפקט שיורית רב-דורי (MGR). מחקר האפקט TG הוא חזק עם מטרה פשוטה כדי לקבוע אם חשיפה כימית להורים יכול לגרום לכל השלכות שיורית על הצאצאים. לאחר ההשפעות נמדדות על ההורים, הנתרן פתרונות היפוכלוניט משמשים כדי להרוג את ההורים ולשמור את הצאצאים כדי להקל על מדידת ההשפעה על הצאצאים. מחקר אפקט TG משמש כדי לקבוע אם הצאצאים מושפעים כאשר הוריהם חשופים המזהמים. המחקר באפקט MGE ו-MGR הוא שיטתית כדי לקבוע אם חשיפה דורי מתמשך יכול לגרום לתגובות אדפטיבית צאצאים מעל דורות. האיסוף הזהיר והעברה משמשים כדי להבדיל בין הדורות כדי להקל על מדידת ההשפעה על כל דור. כמו כן, אנו משלבים פרוטוקולים כדי למדוד התנהגות תנועה, רבייה, תוחלת חיים, ביוכימיה ביטוי גנים שינויים. חלק מהניסויים מוצגות גם כדי להמחיש את מחקרי ההשפעה הטרנס-מרובת הדורות.
Introduction
היישום וניהול פסולת של כימיקלים הוא תלוי מאוד במידע של ההשפעות שלהם בריכוזים מסוימים. בעיקר, הזמן הוא מרכיב חיוני נוסף בין השפעות וריכוזים. כלומר, כימיקלים, במיוחד אלה בריכוזים נמוכים בסביבות בפועל, צריך זמן כדי לעורר השפעות מדידה1. לכן, החוקרים מסדרים באורכים שונים את משך החשיפה בניסויים בבעלי חיים, ואף מכסים את מחזור החיים כולו. לדוגמה, עכברים נחשפו ניקוטין עבור 30, 90 או 180 ימים כדי ללמוד את ההשפעות הרעילות שלה 2. עם זאת, משכי חשיפה כאלה עדיין אינם מספיקים כדי להבהיר את ההשפעות לטווח ארוך של מזהמים (למשל, מזהמים אורגניים מתמידים [פופס]) שיכולים להימשך דורות של אורגניזמים בסביבה. לכן, מחקרים על השפעות על הדורות משיגים יותר ויותר תשומת לב.
ישנם שני היבטים עיקריים בלימודי אפקט הדורות. הראשון הוא מחקר אפקט טרנס (TG) אשר יכול לבדוק אם חשיפה כימית להורים יכול לגרום לכל השלכות על הצאצאים3. השני הוא מחקר רב דורי השפעה אשר שיטתית יותר עם שיקולים הן חשיפה ושרידי אפקטים. מצד אחד, החשיפה הרב-דורי (MGE) משמשות להמחשת התגובות האדפטיבית בבעלי חיים לסביבות מאתגרות לטווח ארוך. מצד שני, ההשפעות שיורית רב הדורות (MGR) משמשות כדי להדגים את ההשלכות לטווח ארוך שיורית לאחר החשיפה, מאז חשיפה אימהית מלווה עם חשיפה העובר לצאצאים הראשונים וחשיפה קו הנבט לשני צאצא שהופך את הצאצא השלישי כדור הראשון לחלוטין מתוך חשיפה4.
למרות היונקים (למשל, עכברים) הם אורגניזמים מודל במחקרים רעילות במיוחד ביחס לבני אדם, היישום שלהם ללמוד תופעות הדור הוא די זמן רב, יקר ומוסרית בנוגע 5. לפיכך, האורגניזמים כולל הסרטריניה מגנה על6, חרק drosophila ילה melanogaster7 ו-דג זברה danio rerio8, לספק בחירות חלופיות. עם זאת, אורגניזמים אלה חסרי דמיון לבני אדם, או דורשים ציוד ספציפי במחקרים.
האלגיה הוא נמטודות קטן לחיות בחינם (כ 1 מ”מ אורך) עם מחזור חיים קצר (כ 84 h ב 20 ° c)9. נמטודות זה משתף מסלולים ביולוגיים רבים שמרני לבני אדם, ולכן הוא הועסק באופן נרחב כדי להמחיש את ההשפעות של מתחים שונים או רעלים הרעילות10. בעיקר, 99.5% של נמטודות הם דו-מיניים עושה את האורגניזמים הזה מתאים מאוד ללמוד תופעות הדור, למשל, TG השפעות של מתכות כבדות, סולולדס3,11, השפעות mge של חלקיקי זהב וכבדים מתכות12 וטמפרטורה13, MGR ההשפעות של סולולאמיד14, והן השפעות mge ו-MGR של גמא הקרנה15 ו lindane4. יתרה מזאת, נמצאו תוצאות דומות בין ההשפעות של כימיקלים (לדוגמה, זאלאלנבי) על פיתוח ושעתוק עכברים ו -C. אלגיה16,17, אשר יספק יתרון לשער השפעות של בעל חיים קטן זה לבני אדם.
שני מחקרי אפקט TG ו-MG הם זמן רב וזקוקים לעיצוב וביצועים זהירים. בעיקר, הבדלים קיימים בבחירות לשלב החיים, בתנאי חשיפה ובשיטות הפרדת הדור במחקרים הנ ל. הבדלים כאלה מעכבת את ההשוואה הישירה בין התוצאות והוא הוסיף פרשנות נוספת של התוצאות. לכן, זה הכרחי להקים פרוטוקולים אחידים כדי להנחות את מחקרי האפקטים TG ו-MG, וגם לספק תמונה גדולה יותר כדי לחשוף דפוסים דומים של רעלים שונים או מזהמים בהשלכות ארוכות טווח. המטרה של הפרוטוקולים הנוכחיים תדגים תהליכי פעולה ברורים בלימוד השפעות טראנס-דוריים ובין האלה. הפרוטוקולים ייהנו מחוקרים המעוניינים ללמוד את ההשפעות ארוכת הטווח של רעלים או מזהמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לנהל בהצלחה את הפרוטוקול המתואר, יש לקחת בחשבון את ההצעות הבאות. בצע את הפעולות הנסיוניות הכלליות בסביבה סטרילית. פעולה לא הולמת עלולה לגרום לזיהום של הזנים E. coli , למשל, פטריות וקרדית יכול לעכב את הצמיחה הרגילה של C. אלגיה ולכן להשפיע על התוצאות הנסיוניות. בסעיף המתאר את טיפוח<em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
References
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
- Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
- Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
- Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
- Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
- Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
- Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
- Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
- Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
- Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
- Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
- Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
- Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
- Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
- Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
- Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
- Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
- Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
- Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).
