Summary

毒性物質のトランスおよび多世代効果の研究のためのカエナルハブ炎エレガンスの使用

Published: July 29, 2019
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Summary

永続的な化学物質のトランスおよび多世代の影響は、環境と人間の健康に対する長期的な影響を判断する上で不可欠です。我々は、自由に生きている線虫カエノルハブ炎エレガンスを用いて、トランスおよび多世代の効果を研究するための新しい詳細な方法を提供する。

Abstract

化学物質の毒性に関する情報は、その用途と廃棄物管理に不可欠です。低濃度の化学物質の場合、長期的な影響は、環境と人間の健康への影響を判断する上で非常に重要です。長期的な影響を実証する上で、最近の研究で世代を超えた化学物質の影響は、新しい洞察を提供します。ここでは、自由に生きている線虫カエオルハブ炎エレガンスを用いて、複数世代にわたる化学物質の効果を研究するためのプロトコルについて説明する。(1)トランスジェネレーション(TG)と(2)多世代効果研究、(後者)を多世代露光(MGE)と多世代残差(MGR)効果スタディに分ける2つの側面を提示する。TG効果研究は、親への化学暴露が子孫に残留結果をもたらす可能性があるかどうかを決定する単純な目的で堅牢です。効果が親に測定された後、次亜塩素酸ナトリウム溶液は、親を殺し、子孫に対する効果測定を容易にするために子孫を保つために使用されます。TG効果試験は、親が汚染物質にさらされたときに子孫が影響を受けるかどうかを判断するために使用されます。MGEおよびMGR効果試験は、連続的な世代暴露が世代を超えて子孫の適応応答をもたらす可能性があるかどうかを決定するために体系的に使用されます。慎重なピックアップと転送は、各世代の効果測定を容易にするために世代を区別するために使用されます。また、プロトコルを組み合わせて、移動挙動、生殖、寿命、生化学的および遺伝子発現の変化を測定しました。いくつかの実験例はまた、トランスおよび多世代効果研究を説明するために提示される。

Introduction

化学物質の適用および廃棄物管理は、特定の濃度での効果の情報に大きく依存します。特に、時間は効果と濃度の間のもう一つの重要な要素です。すなわち、化学物質、特に実際の環境で低濃度のものは、測定可能な効果引き起こす時間を必要とします 1.したがって、研究者は、動物実験で露光期間の異なる長さを配置し、さらにはライフサイクル全体をカバーします。例えば、マウスは、その毒性効果2を研究するために30、90または180日間ニコチンにさらされた。 しかし、このような暴露期間は、環境中の生物の世代にわたって持続する汚染物質(例えば、持続的な有機汚染物質[POP])の長期的な影響を解明するのに十分ではありません。したがって、世代を超えた効果に関する研究はますます注目を集めています。

世代効果研究には主に2つの側面があります。1つ目は、親への化学暴露が子孫3に何らかの影響をもたらすかどうかを強くテストできるトランスジェネレーション(TG)効果試験です。2つ目は、露出効果と残留効果の両方を考慮した、より体系的な多世代効果研究です。一方で、多世代暴露(MGE)効果は、長期的に困難な環境に対する動物の適応応答を示すために使用される。一方、母体暴露は第1子子への胚暴露と第2の生殖線暴露を伴うため、多世代残差(MGR)効果は、暴露後の長期的な残留結果を実証するために使用される。第三世代として第三の子孫を露出から完全に外す子孫4.

哺乳動物(例えば、マウス)は、特にヒトに関連する毒性研究におけるモデル生物であるが、世代的影響の研究におけるその応用は非常に時間がかかり、高価で倫理的に5に関する。したがって、甲殻類ダフニアマグナ6、昆虫ショウジョウバエメラノガスター7およびゼブラフィッシュダニオレリオ8を含む生物は、代替選択肢を提供する。しかし、これらの生物は人間との類似性を欠いているか、研究に特定の装置を必要とします。

カエオルハブ炎エレガンスは、短いライフサイクル(20°Cで約84時間)9の小さな自由に生きている線虫(長さ約1mm)です。この線虫は、人間に対して保守的な多くの生物学的経路を共有し、したがって、様々なストレスまたは毒性物質10の効果を示すために広く採用されている。特に、線虫の99.5%は、重金属やスルホンアミド3、11、金ナノ粒子および重体のMGE効果の生成効果など、世代的効果の研究に非常に適したこの生物を作るハーマフロダイトである。金属12および温度13、スルホンアミド14のMGR効果、およびガンマ照射15およびリンダン4のMGEおよびMGR効果の両方が及ぶ。さらに、マウスとC.エレガンス16、17の発達および繁殖に及ぼす化学物質(例えばゼアラレノン)の効果との間に同等の結果が見出された。この小動物から人間への影響。

TG と MG 効果の研究は両方の時間がかかり、慎重な設計とパフォーマンスが必要です。.特に、前述の研究では、ライフステージの選択、暴露条件、および生成分離方法に違いが存在していました。このような違いは、結果間の直接比較を妨げ、結果のさらなる解釈を妨げました。したがって、TGおよびMG効果研究を導く統一プロトコルを確立し、また、長期的な結果における様々な毒性物質または汚染物質の同様のパターンを明らかにするために、より大きな画像を提供することが不可欠である。本プロトコルのオーバーゴールは、C.エレガンスとのトランスおよび多世代効果を研究する際の明確な操作プロセスを示す。プロトコルは、有毒物質や汚染物質の長期的な影響を研究することに興味を持っている研究者に利益をもたらす.

Protocol

1. 培養大腸菌OP50 水酸化ナトリウム4gを100mLの水に溶解して1M水酸化ナトリウム溶液を調出す。 リソジェニーブロス(LB)培地を1L円錐フラスコに10gのトリプトン、5gの酵母エキス、10gの塩化ナトリウムを1Lの円錐形フラスコに溶解させ、1Lの円錐形のフラスコに1Lの超純水を溶かして調剤する。水酸化ナトリウム溶液1MでpHを7.0に調整します。 ステップ1.2から20円錐フラ?…

Representative Results

ここでは、世代間(TG)、多世代暴露(MGE)および多世代残差(MGR)効果研究におけるC.エレガンスを用いて世代を超えた化学物質の効果を研究するためのプロトコルについて述べた。独自の研究成果を事例として紹介します。ある研究は、移動行動3に対する重金属のTG効果を提示する。他の2つの研究は、再生および生化学的および遺伝的指標の測定?…

Discussion

記述されたプロトコルを正常に実行するためには、次の提案を考慮する必要があります。無菌環境で全体的な実験操作を実行します。不適切な操作は、大腸菌株の汚染、例えば、真菌およびダニは、C.エレガンスの正常な成長を妨げる可能性があり、したがって、実験結果に影響を与える可能性があります。C.エレガンスの栽培について説明するセクションでは、裸眼また…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar,Corning,America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

References

  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).

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Cite This Article
Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

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