Verwendung von Caenorhabditis elegans zur Untersuchung der trans- und mehrgenerationenlichen Wirkungen von Toxischen Stoffen
Summary
Trans- und mehrgenerationenische Wirkungen persistenter Chemikalien sind für die Beurteilung ihrer langfristigen Folgen für die Umwelt und die menschliche Gesundheit von wesentlicher Bedeutung. Wir bieten neuartige detaillierte Methoden zur Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten mit der freilebenden Nematode Caenorhabditis elegans.
Abstract
Informationen über Toxizitäten von Chemikalien sind für ihre Anwendung und Abfallbewirtschaftung von wesentlicher Bedeutung. Bei Chemikalien in niedrigen Konzentrationen sind die langfristigen Auswirkungen sehr wichtig, um ihre Folgen für die Umwelt und die menschliche Gesundheit zu beurteilen. Bei der Demonstration langfristiger Einflüsse liefern die Auswirkungen von Chemikalien über Generationen hinweg in neueren Studien neue Erkenntnisse. Hier beschreiben wir Protokolle zur Untersuchung der Wirkung von Chemikalien über mehrere Generationen mit frei lebenden Nematoden Caenorhabditis elegans. Zwei Aspekte werden vorgestellt: (1) trans-generationale (TG) und (2) Mehrgenerationeneffektstudien, von denen letztere durch Mehrgenerationenexposition (MGE) und Mehrgenerationen-Resteffektstudien (MGR) getrennt sind. Die TG-Effektstudie ist robust mit einem einfachen Zweck, um festzustellen, ob eine chemische Exposition gegenüber Eltern zu Restfolgen für den Nachwuchs führen kann. Nachdem die Auswirkungen auf die Eltern gemessen wurden, werden Natriumhypochlorit-Lösungen verwendet, um die Eltern zu töten und den Nachwuchs zu halten, um die Wirkungsmessung auf den Nachwuchs zu erleichtern. Die TG-Effektstudie wird verwendet, um festzustellen, ob die Nachkommen betroffen sind, wenn ihr Elternteil den Schadstoffen ausgesetzt ist. Die MGE- und MGR-Effektstudie wird systematisch verwendet, um festzustellen, ob eine kontinuierliche Generationenexposition zu adaptiven Reaktionen bei Nachkommen über Generationen führen kann. Sorgfältige Abholung und Übertragung werden verwendet, um Generationen zu unterscheiden, um die Wirkungsmessung an jeder Generation zu erleichtern. Wir haben auch Protokolle kombiniert, um Das Bewegungsverhalten, die Fortpflanzung, die Lebensdauer, die biochemischen und Genexpressionsänderungen zu messen. Einige Beispielexperimente werden auch vorgestellt, um die trans- und mehrgenerationenischen Effektstudien zu veranschaulichen.
Introduction
Die Anwendung und Abfallbewirtschaftung von Chemikalien hängt in hohem Maße von der Information ihrer Auswirkungen bei bestimmten Konzentrationen ab. Insbesondere ist die Zeit ein weiteres wesentliches Element zwischen Wirkungen und Konzentrationen. Das heißt, Chemikalien, insbesondere solche mit geringen Konzentrationen in den tatsächlichen Umgebungen, brauchen Zeit, um messbare Effekte zu provozieren1. Daher ordnen die Forscher unterschiedliche Längen der Expositionsdauer in Tierversuchen an und decken sogar den gesamten Lebenszyklus ab. Zum Beispiel waren Mäuse für 30, 90 oder 180 Tage Nikotin ausgesetzt, um seine toxischen Wirkungen zu untersuchen 2. Dennoch reichen solche Expositionsdauern immer noch nicht aus, um die langfristigen Auswirkungen von Schadstoffen (z. B. persistente organische Schadstoffe [POP]) aufzuklären, die über Generationen von Organismen in der Umwelt andauern können. Daher gewinnen Studien über Auswirkungen über Generationen immer mehr Aufmerksamkeit.
Es gibt zwei Hauptaspekte in Generationeneffektstudien. Die erste ist die transgenerationale (TG) Effektstudie, die robust testen kann, ob eine chemische Exposition gegenüber Eltern Auswirkungen auf den Nachwuchs haben kann3. Die zweite ist eine Mehrgenerationen-Effektstudie, die systematischer ist und sowohl bei der Exposition als auch bei den Resteffekten berücksichtigt wird. Einerseits werden die Multi-Generationen-Expositionseffekte (MGE) verwendet, um adaptive Reaktionen bei Tieren auf die langfristig herausfordernden Umgebungen zu veranschaulichen. Andererseits werden die Mehrgenerationen-Resteffekte (MGR) verwendet, um die langfristigen Restfolgen nach der Exposition zu demonstrieren, da die mütterliche Exposition mit einer Embryo-Exposition gegenüber den ersten Nachkommen und einer Keimbahn-Exposition gegenüber der zweiten Nachkommen, die den dritten Nachwuchs als erste Generation vollständig aus der Exposition4macht.
Obwohl Säugetiere (z. B. Mäuse) Musterorganismen in Toxizitätsstudien sind, insbesondere in Bezug auf den Menschen, ist ihre Anwendung bei der Untersuchung von Generationenwirkungen recht zeitaufwändig, teuer und ethisch in Bezug auf 5. Dementsprechend bieten Organismen wie die Krebstiere Daphnia magna6, Dasinsekt Drosophila melanogaster7 und der Zebrafisch Danio rerio8alternative Möglichkeiten. Doch diese Organismen haben entweder keine Ähnlichkeiten mit dem Menschen oder benötigen spezifische Ausrüstung in Studien.
Caenorhabditis elegans ist eine kleine freilebende Nematode (ca. 1 mm lang) mit einem kurzen Lebenszyklus (ca. 84 h bei 20 °C)9. Diese Nematode teilt viele biologische Wege konservativ für den Menschen, und daher wurde es weit verbreitet verwendet, um die Auswirkungen von verschiedenen Belastungen oder Giftstoffe zu veranschaulichen10. Insbesondere sind 99,5% der Nematoden Hermaphrodite, die diese Organismen sehr geeignet machen, um Generationeneffekte zu untersuchen, z. B. TG-Effekte von Schwermetallen und Sulfonamiden3,11, MGE-Effekte von Gold-Nanopartikeln und schweren Metalle12 und Temperatur13, MGR-Effekte von Sulfonamid14, und sowohl MGE und MGR-Effekte der Gamma-Bestrahlung15 und Lindan4. Darüber hinaus wurden vergleichbare Ergebnisse zwischen den Wirkungen von Chemikalien (z. B. Zearalenon) auf die Entwicklung und Fortpflanzung von Mäusen und C. elegans16,17gefunden, was einen Vorteil für die Extrapolatung Auswirkungen dieses kleinen Tieres auf den Menschen.
Sowohl TG- als auch MG-Effektstudien sind zeitaufwändig und benötigen sorgfältiges Design und Leistung. Insbesondere bestanden in den oben genannten Studien Unterschiede bei der Wahl des Lebensstadiums, den Expositionsbedingungen und den Methoden der Generationstrennung. Diese Unterschiede behinderten den direkten Vergleich der Ergebnisse und behinderten die weitere Interpretation der Ergebnisse. Daher ist es unerlässlich, einheitliche Protokolle zur Orientierung von TG- und MG-Effektstudien zu erstellen und auch ein größeres Bild zu liefern, um ähnliche Muster verschiedener Giftstoffe oder Schadstoffe in langfristigen Folgen aufzudecken. Das überzielige Ziel der vorliegenden Protokolle wird klare Arbeitsabläufe bei der Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten mit C. elegansdemonstrieren. Die Protokolle werden Forschern zugute kommen, die daran interessiert sind, die langfristigen Auswirkungen von Giftstoffen oder Schadstoffen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um das beschriebene Protokoll erfolgreich durchführen zu können, sollten die folgenden Vorschläge berücksichtigt werden. Führen Sie die gesamten experimentellen Operationen in einer sterilen Umgebung durch. Unsachgemäße Bedienung kann zu einer Kontamination der E. coli-Stämme führen, z. B. Pilze und Milben können das normale Wachstum von C. elegans behindern und somit die experimentellen Ergebnisse beeinflussen. Beobachten Sie im Abschnitt, der die Kultivierung von C. elegans beschrei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
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