Utilisation de Caenorhabditis elegans pour étudier les effets trans et multigénérationnels des substances toxiques
Summary
Les effets trans et multigénérationnels des produits chimiques persistants sont essentiels pour juger de leurs conséquences à long terme sur l’environnement et sur la santé humaine. Nous fournissons de nouvelles méthodes détaillées pour étudier les effets trans et multigénérationnels en utilisant le nématode caenorhabditis elegans.
Abstract
L’information sur les toxicités des produits chimiques est essentielle à leur application et à la gestion des déchets. Pour les produits chimiques à faibles concentrations, les effets à long terme sont très importants pour juger de leurs conséquences sur l’environnement et sur la santé humaine. En démontrant des influences à long terme, les effets des produits chimiques au fil des générations dans des études récentes fournissent de nouvelles perspectives. Ici, nous décrivons des protocoles pour étudier des effets des produits chimiques sur plusieurs générations utilisant le nématode libre Caenorhabditis elegans. Deux aspects sont présentés : (1) les études d’effets multigénérationnels (TG) et (2) multigénérationnelles, dont cette dernière est séparée des études d’effet multigénérationnels (MGE) et multigénérationnelles résiduelles (MGR). L’étude sur l’effet TG est robuste dans un but simple pour déterminer si l’exposition chimique aux parents peut entraîner des conséquences résiduelles sur la progéniture. Une fois que les effets sont mesurés sur les parents, des solutions d’hypochlorite de sodium sont utilisées pour tuer les parents et garder la progéniture afin de faciliter la mesure de l’effet sur la progéniture. L’étude sur l’effet TG est utilisée pour déterminer si la progéniture est affectée lorsque son parent est exposé aux polluants. L’étude d’effet MGE et MGR est systématique pour déterminer si l’exposition générationnelle continue peut entraîner des réponses adaptatives chez les enfants au fil des générations. Le ramassage et le transfert soigneux sont utilisés pour distinguer les générations afin de faciliter la mesure de l’effet sur chaque génération. Nous avons également combiné des protocoles pour mesurer le comportement de locomotion, la reproduction, la durée de vie, les changements biochimiques et d’expression génique. Quelques exemples d’expériences sont également présentés pour illustrer les études d’effets trans et multigénérationnels.
Introduction
L’application et la gestion des déchets de produits chimiques dépendent fortement de l’information sur leurs effets à certaines concentrations. Notamment, le temps est un autre élément essentiel entre les effets et les concentrations. C’est-à-dire que les produits chimiques, en particulier ceux à faibles concentrations dans les environnements réels, ont besoin de temps pour provoquer des effets mesurables1. Par conséquent, les chercheurs organisent différentes longueurs de la durée d’exposition dans les expériences animales, et couvrent même l’ensemble du cycle de vie. Par exemple, les souris ont été exposées à la nicotine pendant 30, 90 ou 180 jours pour étudier ses effets toxiques 2. Pourtant, de telles durées d’exposition ne suffisent toujours pas à élucider les effets à long terme des polluants (p. ex., les polluants organiques persistants [POP]) qui peuvent durer sur des générations d’organismes dans l’environnement. Par conséquent, les études sur les effets au fil des générations gagnent de plus en plus d’attention.
Il y a deux aspects principaux dans les études d’effets générationnels. La première est l’étude d’effet transgénérationnel (TG) qui peut tester avec robustesse si l’exposition chimique aux parents peut entraîner des conséquences sur la progéniture3. La deuxième est une étude multigénérationnelle d’effet qui est plus systématique avec des considérations dans l’exposition et les effets résiduels. D’une part, les effets d’exposition multigénérationnelle (MGE) sont utilisés pour illustrer les réponses adaptatives chez les animaux aux environnements difficiles à long terme. D’autre part, les effets résiduels multigénérationnels (MGR) sont utilisés pour démontrer les conséquences résiduelles à long terme après l’exposition, puisque l’exposition maternelle est accompagnée d’une exposition à l’embryon à la première progéniture et d’une exposition à la lignée germinale à la seconde progéniture qui fait la troisième progéniture comme la première génération complètement hors de l’exposition4.
Bien que les mammifères (p. ex. les souris) soient des organismes modèles dans les études de toxicité, en particulier en ce qui concerne les êtres humains, leur application dans l’étude des effets générationnels est assez longue, coûteuse et éthiquement préoccupante 5. En conséquence, les organismes, y compris le crustacé Daphnia magna6, l’insecte Drosophila melanogaster7 et le poisson zèbre Danio rerio8, offrent des choix alternatifs. Pourtant, ces organismes n’ont pas de similitudes avec les êtres humains, ou ont besoin d’équipement spécifique dans les études.
Caenorhabditis elegans est un petit nématode libre (environ 1 mm de longueur) avec un cycle de vie court (environ 84 h à 20 oC)9. Ce nématode partage de nombreuses voies biologiques conservatrices pour les êtres humains, et donc il a été largement utilisé pour illustrer les effets de divers stress ou toxiques10. Notamment, 99,5% des nématodes sont hermaphrodites rendant ces organismes extrêmement appropriés dans l’étude des effets générationnels, par exemple, les effets TG des métaux lourds et des sulfonamides3,11, effets MGE des nanoparticules d’or et de lourds métaux12 et température13, effets MGR de sulfonamide14, et les deux effets MGE et MGR de l’irradiation gamma15 et lindane4. En outre, des résultats comparables ont été trouvés entre les effets des produits chimiques (par exemple, zearalenone) sur le développement et la reproduction des souris et C. elegans16,17, ce qui fournirait un avantage à extrapoler effets de ce petit animal pour les êtres humains.
Les études d’effet TG et MG prennent du temps et nécessitent une conception et des performances soigneuses. Notamment, des différences existaient dans les choix de stade de vie, les conditions d’exposition et les méthodes de séparation des générations dans les études susmentionnées. Ces différences ont entravé la comparaison directe entre les résultats et entravé une interprétation plus poussée des résultats. Par conséquent, il est impératif d’établir des protocoles uniformes pour guider les études sur les effets TG et MG, et aussi de fournir une vue d’ensemble pour révéler des modèles similaires de divers substances toxiques ou polluants dans les conséquences à long terme. L’objectif excédentaire des protocoles actuels démontrera des processus opérationnels clairs dans l’étude des effets trans et multigénérationnels avec C. elegans. Les protocoles profiteront aux chercheurs intéressés à étudier les effets à long terme des substances toxiques ou polluantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afin de mener avec succès le protocole décrit, les suggestions suivantes doivent être prises en considération. Effectuer l’ensemble des opérations expérimentales dans un environnement stérile. Une mauvaise exploitation peut entraîner la contamination des souches d’E. coli, par exemple, les champignons et les acariens peuvent entraver la croissance normale de C. elegans et donc affecter les résultats expérimentaux. Dans la section décrivant la culture de C. elegans, observez l’échel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
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