Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados
Summary
Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.
Abstract
A investigação das interações intercelulares exige frequentemente a rotulagem discreta de populações específicas da pilha e a localização precisa da proteína. O embrião zebrafish é uma excelente ferramenta para examinar essas interações com um modelo in vivo. Ensaios imunoistoquímicos e imunofluorescência de montagem total são freqüentemente aplicados em embriões de zebrafish para avaliar a expressão protéica. Entretanto, pode ser difícil conseguir o traço exato de proteínas colocalizadas no espaço tridimensional. Além disso, alguns estudos podem requerer a utilização de dois anticorpos que não são compatíveis com a mesma técnica (por exemplo, o anticorpo 1 só é adequado para imunohistoquímica e o anticorpo 2 só é adequado para a imunofluorescência). A finalidade do método descrito nisto é executar a imunofluorescência seqüencial e/ou immunohistochemistry em Cryosections individuais derivados dos embriões do zebrafish do cedo-estágio. Aqui nós descrevemos o uso de círculos seqüenciais da imunofluorescência, imagem latente, Immunohistochemistry, imagem latente para um único criossecção a fim conseguir a identificação precisa da expressão da proteína a nível da único-pilha. Esta metodologia é adequada para qualquer estudo em embriões de zebrafish de fase precoce que requeira identificação precisa de múltiplos alvos proteicos em células individuais.
Introduction
O zebrafish é um organismo modelo extremamente robusto que é usado atualmente através de uma grande variedade de disciplinas na pesquisa biomédica. Em particular, o rápido desenvolvimento externo e a translucidez dos embriões de zebrafish proporcionam uma excelente ferramenta para estudos in vivo. Nisto, nós descrevemos um método para a imunofluorescência seqüencial (se) e as análises immunohistochemical (IHC) de embriões cryosectioned do zebrafish. Este procedimento novo usa a aplicação seqüencial de dois anticorpos em uma única corrediça, permitindo a identificação exata de proteínas colocalizadas a nível celular ao conservar seções do tecido. Este protocolo é particularmente útil para estudos com o modelo zebrafish, uma vez que um número relativamente pequeno de anticorpos foram validados para uso em aplicações de IF e/ou IHC em zebrafish em comparação com modelos de mouse.
A observação de interações intercelulares é um elemento essencial em muitos estudos, e pode fornecer insights-chave em mecanismos moleculares que funcionam a nível celular que sustentam os fenótipos no nível organizmal. Adicionalmente, a expressão da proteína pode fornecer a informação sobre a função celular, especial ao examinar a expressão de proteínas múltiplas simultaneamente dentro da pilha (colocalização). Embora o IHC de montagem total e se sejam técnicas comumente usadas para analisar a expressão protéica em embriões de zebrafish1,2,3,4,5, os procedimentos de montagem inteira podem ser problemático para alcançar dados de colocalização precisos. Em nossa experiência, pode ser difícil diferenciar entre camadas de tecido e visualizar a expressão da proteína no nível da único-pilha em espécimes da inteiro-montagem. Os programas de software da imagem latente podem geralmente ser incapazes de distinguir entre a mancha de superfície contra a mancha mais profunda. Expressões de proteínas de nível não superficial podem ser obscurecidas por expressão de nível de superfície mais brilhantemente expressa, levando a imprecisões na quantificação. Adicionalmente, a maioria de métodos tradicionais do clearing do zebrafish são completamente tóxicos6 e assim menos desejável para o uso.
Técnicas baseadas em anticorpos, como IF e IHC, são freqüentemente usadas para detectar a expressão protéica em material seccionado, simplificando a identificação de populações de células discretas que expressam uma determinada proteína dentro de tecidos complexos. O IHC é comumente usado para colocalização, mais freqüentemente usando dois anticorpos diferentes conjugados em diferentes espécies hospedeiras e visualizados com diferentes cromogénios coloridos4,7, 8,9 , 10. no entanto, o uso de múltiplos cromogénios pode levar a coloração de fundo não específica ou incompatibilidade de cores11,12.
Nós desenvolvemos um protocolo novo para a deteção de proteínas múltiplas pelo IF seqüencial e pelo IHC em embriões cryosectioned do zebrafish da fase inicial. O criseccionamento é particularmente adequado para tecidos delicados, como embriões de zebrafish, e crisecções são superiores às secções encaixadas em parafina para ensaios à base de fluorescência13,14. Optou-se por otimizar o IF e o IHC combinados em vez de Dual-Color IF ou IHC, para contornar o problema da incompatibilidade de anticorpos para um único tipo de ensaio. Estes problemas são particularmente relevantes para a investigação envolvendo o zebrafish devido ao número limitado de anticorpos comercialmente disponíveis que são validados para uso em zebrafish. De facto, um estudo de quatro grandes companhias mostrou que os anticorpos comercialmente disponíveis para o uso no rato eram aproximadamente 112.000 contra aproximadamente 5.300 para o uso no zebrafish15. Por fim, optou-se por desenvolver um protocolo que pudesse ser realizado em uma única crissecção, que é essencial quando se trabalha com amostras de tecido pequenas ou limitadas, como são obtidas a partir de embriões de zebrafish.
Este protocolo foi projetado para avaliar o comportamento proliferativo de células doadoras em embriões de zebrafish quimérico de 48 h pós-fertilização que foram gerados por transplante de blastula-a-blastula como descrito por Carmany-Rampey e moens16. Os embriões doadores foram injetados no estágio da um-pilha com um conjugado cDNAs etiquetado do dextrano antes do transplante de pilhas fornecedoras em embriões do receptor. Nós usamos a imunofluorescência para ser 10 fosforilated histone H3 (PH3) para detectar as pilhas proliferating seguidas por immunohistochemistry para o dextrano etiquetado para detectar pilhas fornecedoras em embriões quimérico do zebrafish. A deteção seqüencial de PH3 e o dextrano etiquetado dentro de um único criossecção permitiram-nos de identificar e quantificar as pilhas individuais que expressaram ambos os marcadores.
Este protocolo seqüencial de IF/IHC para o zebrafish cryosectioned fornecerá uma ferramenta útil para os investigadores do zebrafish que desejam um protocolo da colocalização para a expressão da proteína. Os problemas que este protocolo foi projetado endereçar, tais como espécimes pequenos do tecido e a disponibilidade limitada do anticorpo, não são originais ao modelo do zebrafish. Este método pode, portanto, ser de uso para qualquer pesquisador desejando executar seqüencial IF/IHC.
DECLARAÇÃO DE ÉTICA:
Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual da Carolina do Norte, Raleigh, Carolina do Norte, EUA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós apresentamos um método novo para a imunofluorescência combinada e immunohistochemistry que representa uma etapa importante para a frente em executar experiências da colocalização em embriões cryosectioned do zebrafish. Há uma falta crítica de protocolos existentes da colocalização que são otimizados para o uso com embriões pequenos e o material cryosectioned17,18, ambo são usados de outra maneira geralmente em estudos moleculars14. Os protocolos de colocalização existentes concentram-se principalmente na visualização simultânea de dois fluoróforos17,18. Embora esses protocolos possam funcionar bem, sua utilidade é limitada pela disponibilidade de anticorpos que (i) podem ser usados em zebrafish e (II) são compatíveis com o IF.
Nós sentimos que o uso do criossecção para embriões do zebrafish fornece uma vantagem significativa nos termos da morfologia preservada do tecido. Porque o IHC é executado mais geralmente em seções da parafina do que Cryosections7,8, uma exploração mais adicional de métodos cryosection-baseados de IHC para a deteção da expressão da proteína é justificada. O uso de toda a montagem se é um método comum para visualizar os níveis de expressão em embriões de zebrafish, e é mais comumente descrito na literatura do que se usando Cryosections1,2,3,4, a 19. Entretanto, os protocolos inteiros da montagem têm limitações, incluindo a falta da localização exata das proteínas expressadas em tecidos profundos e o potencial para a expressão nivelada de superfície para obscurecer a expressão da proteína em uns tecidos mais profundos. Nós observamos consistentemente a manutenção excelente da morfologia celular depois da criopreservação, do seccionamento, e do IF e do IHC sequenciais. Para aplicativos que exigem localização precisa de expressão protéica no nível de célula única, há uma vantagem significativa para procedimentos baseados em seção como descrevemos neste protocolo. A incorporação da resina fornece uma opção alternativa para executar ensaios de IF ou de IHC em seções dos embriões do zebrafish do cedo-estágio20. As seções da resina fornecem a preservação superior da morfologia do tecido comparada aos Cryosections, e as seções relativamente mais finas do tecido podem ser preparadas. No entanto, os fabricantes geralmente não recomendam o uso de seções de resina para ensaios imuno-baseados, como alguns componentes das resinas não podem ser removidos das seções e podem mascarar sites de ligação de anticorpos21.
Embora todo o protocolo seja essencial para uma análise precisa e bem-sucedida dos padrões de expressão, algumas etapas específicas são críticas para o sucesso experimental. O primeiro passo crítico é o manejo de embriões durante a incorporação em13de outubro de14. Pode ser desafiador orientar cada embrião no mesmo plano transversal para que as seções sejam cortadas de aproximadamente a mesma área para todos os embriões. Descobrimos que o uso de pequenas agulhas de bitola para realizar pequenos movimentos deliberados através do meio de OCT viscoso para orientação embrionária é superior ao uso de fórceps, que são muito grandes e deslocar muito médio de OCT. Uma segunda etapa crítica ocorre durante o corte de blocos congelados, pois pode ser difícil obter seções de alta qualidade que contenham o (s) tecido (es) desejado sem treinamento e experiência significativos. Assim, recomendamos o uso de amostras de teste até que a técnica seja dominada. Um terceiro passo crítico é a remoção de lamínula, que tem o potencial de perturbar ou descascar amostras de tecido. Nós descobrimos que uma combinação de agitação suave para afrouxar a lamínula e a remoção lenta da corrediça do recipiente de PBS é a aproximação a mais eficaz para remover os lamela. Uma mão delicada e firme é A melhor; pesquisadores podem achar que algum julgamento e erro é necessário para aprender a remover os COVERSLIP efetivamente.
As etapas importantes adicionais no protocolo incluem a optimização do anticorpo (anticorpos preliminares e secundários para ambos os ensaios de If e de IHC) e a exposição das corrediças ao substrato e à contratura cromogênico. Uma pesquisa aprofundada sobre a especificidade do anticorpo primário e a concentração alvo é essencial; Geralmente, é melhor coletar amostras não-preciosas suficientes para pelo menos dois experimentos separados para IF e IHC que serão realizados para otimizar as concentrações primárias de anticorpos antes de iniciar a combinação IF/IHC. Incluir um controle positivo e negativo conhecido para cada anticorpo preliminar é essencial em cada experimento para assegurar-se de que ambos os ensaios de IF e de IHC estejam realizando apropriadamente. Os ajustes à concentração secundária do anticorpo podem igualmente ser necessários. A otimização da exposição de secções teciduais ao substrato cromogênico e à contratura para o ensaio IHC é necessária, uma vez que as diretrizes do fabricante frequentemente descrevem uma ampla gama de possíveis tempos de exposição. Nem todos os cromogénios podem ser compatíveis com as contrações e a pigmentação endógena do tecido, exigindo o planeamento cuidadoso no que diz respeito à seleção do cromogénio.
Há umas modificações potenciais numerosas que podem ser aplicadas ao protocolo descrito, e nós executamos com sucesso este protocolo com outras combinações de anticorpos que não poderiam ambos ser usados para o se. Como aludido acima, as substâncias cromogênico têm a compatibilidade distinta com as contrações específicas. Descobrimos que esses componentes são facilmente modificáveis no protocolo. Adicionalmente, os parâmetros para a incubação do anticorpo são completamente flexíveis, e podem ser aumentados ou diminuído dependendo da intensidade de coloração desejada. O processo de incorporação também pode ser modificado. Quando nós focarmos em seções transversais, os embriões podem facilmente ser orientados em todo o sentido endereçar os tecidos particulares do interesse. Finalmente, existem vários pontos de pausa possíveis neste protocolo. Os embriões desidratados podem ser armazenados em 100% MeOH em-20 ° c por alguns meses; os blocos congelados podem ser armazenados em-80 ° c por até três meses; e as corrediças preparadas podem ser armazenadas em-80 ° c por até nove meses em uma caixa de corrediça.
Devido à complexidade relativa deste protocolo combinado de IF/IHC, há umas fontes possíveis múltiplas da variação ou do erro que podem exigir a solução de problemas, variando da qualidade do tecido à experiência do investigador à manipulação da amostra. A maioria das etapas críticas descritas acima são consideradas críticas porque exigem otimização no nível de usuário individual ou exigem destreza, habilidade e experiência específicas. No entanto, descobrimos que a coloração de fundo não específica e a baixa intensidade do sinal são as questões mais importantes que exigem otimização. Tal como com qualquer protocolo IF ou IHC, abordar estas questões pode ser demorado e trabalhoso, e pode ser agravado com este método, uma vez que as duas técnicas são combinadas. Por esse motivo, é altamente recomendável otimizar o IF e o IHC separadamente antes de prosseguir com o protocolo combinado.
Enquanto nós prevemos que este método será útil para uma ampla gama de experimentos, existem potenciais limitações. O desempenho bem sucedido deste procedimento é dependente de manter amostras intactas do tecido através de dois experimentos seqüenciais que incluem etapas numerosas da lavagem. Por esta razão, quaisquer problemas que surgem durante o corte ou manuseio de tecidos, incluindo o uso de slides mais antigos que podem ter degradado na qualidade, irá limitar significativamente a capacidade dos pesquisadores para executar este protocolo com sucesso. Embora os slides possam ser potencialmente armazenados em-80 ° c por até nove meses, a aderência dos tecidos às lâminas diminui ao longo do tempo e tivemos o melhor sucesso com slides que são usados dentro de um mês de preparação ou idealmente, no dia seguinte. Uma segunda limitação é a pegada pequena de embriões do zebrafish. Embora tenhamos encontrado este experimento para ser útil na visualização de proteínas que são relativamente abundantemente expressas em embriões de estágio inicial, as proteínas que são expressas de forma inconsistente ou em níveis baixos podem ser muito difíceis de capturar em uma seção. Finalmente, uma vez que o protocolo utiliza crisecções 10 \ u201212 μm, é mais adequado para a avaliação da expressão protéica em estruturas maiores, tais como núcleos, ao invés de menores componentes sub-celulares.
Em resumo, nosso protocolo IF/IHC combinado será vantajoso para uma grande variedade de estudos em embriões de zebrafish de estágio inicial, e representa uma importante inovação na análise de expressão protéica precisa em tais espécimes. Nosso método, mostrado com sucesso na Figura 5, permitirá que os pesquisadores preservem a delicada morfologia dos embriões de zebrafish em estágio inicial em critisecções, enquanto trabalham com o intervalo um pouco limitado de anticorpos primários atualmente disponíveis que são validado para uso em IF ou IHC nesta espécie. Este protocolo será provavelmente útil para estudos em outros peixes e espécies de anfíbios (por exemplo, Medaka e Xenopus spp.), que são dificultados por limitações semelhantes à disponibilidade de anticorpos, podendo ser aplicáveis a modelos tradicionais de mamíferos como Bem.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por NIH Grant 5K01OD021419-02 e NC Universidade Estadual da faculdade de medicina veterinária.
Materials
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1X phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10X phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1X PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1000 in 1x PBS for IF |
| 1X Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1X TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
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