Immunofluorescence séquentielle et immunohistochimie sur les embryons de poissons zèbres cryosectionnés
Summary
Ce protocole démontre l’immunofluorescence séquentielle et l’immunohistochimie sur des cryosections des embryons de poisson zèbre de stade précoce permettant des analyses précises de colocalisation dans des populations cellulaires spécifiques.
Abstract
L’étude des interactions intercellulaires exige souvent l’étiquetage discret des populations cellulaires spécifiques et la localisation précise de protéine. L’embryon de poisson zèbre est un excellent outil pour examiner de telles interactions avec un modèle in vivo. Des tests immunohistochimiques et immunofluorescence s’appliquent fréquemment dans les embryons de poissons zèbres pour évaluer l’expression des protéines. Cependant, il peut être difficile d’obtenir une cartographie précise des protéines colocalisées dans l’espace tridimensionnel. En outre, certaines études peuvent nécessiter l’utilisation de deux anticorps qui ne sont pas compatibles avec la même technique (par exemple, l’anticorps 1 ne convient qu’à l’immunohistochimie et l’anticorps 2 ne convient qu’à l’immunofluorescence). Le but de la méthode décrite ci-dessus est d’effectuer l’immunofluorescence séquentielle et/ou l’immunohistochemistry sur des cryosections individuelles dérivées des embryons de poisson zèbre de stade précoce. Ici nous décrivons l’utilisation des tours séquentiels de l’immunofluorescence, de l’imagerie, de l’immunohistochimie, de la formation image pour une seule cryosection afin d’atteindre l’identification précise de l’expression de protéine au niveau unicellulaire. Cette méthodologie convient à toute étude sur les embryons de poissons zèbres à un stade précoce qui nécessite une identification précise de plusieurs cibles protéiques dans des cellules individuelles.
Introduction
Le poisson zèbre est un organisme modèle extrêmement robuste qui est actuellement utilisé dans une grande variété de disciplines dans la recherche biomédicale. En particulier, le développement externe rapide et la translucidité des embryons de poissons zèbres constituent un excellent outil pour les études in vivo. Ici, nous décrivons une méthode pour l’immunofluorescence séquentielle (IF) et les analyses immunohistochemical (IHC) des embryons cryosectionnés de poisson zèbre. Cette nouvelle procédure utilise l’application séquentielle de deux anticorps sur une seule diapositive, permettant l’identification précise des protéines colocalisées au niveau cellulaire tout en conservant des sections de tissu. Ce protocole est particulièrement utile pour les études avec le modèle du poisson zèbre, car un nombre relativement faible d’anticorps ont été validés pour une utilisation dans les applications IF et/ou IHC chez le poisson zèbre par rapport aux modèles murins.
L’observation des interactions intercellulaires est un élément essentiel dans de nombreuses études, et peut fournir des informations clés sur les mécanismes moléculaires fonctionnant au niveau cellulaire qui sous-tendent les phénotypes au niveau de l’organisation. En outre, l’expression des protéines peut fournir des informations sur la fonction cellulaire, en particulier lors de l’examen de l’expression de plusieurs protéines simultanément dans la cellule (co-localisation). Bien que l’IHC et la FI à monture entière soient des techniques couramment utilisées pour analyser l’expression des protéines dans les embryons de poissons zèbres1,2,3,4,5, les procédures de montage entier peuvent être pour obtenir des données précises de colocalisation. D’après notre expérience, il peut être difficile de différencier les couches de tissu et de visualiser l’expression des protéines au niveau unicellulaire chez des spécimens à monture entière. Les logiciels d’imagerie peuvent généralement être incapables de faire la distinction entre la coloration de surface et la coloration plus profonde. Les expressions protéiques non-surface peuvent être masquées par une expression plus vive au niveau de la surface, ce qui entraîne des inexactitudes dans la quantification. En outre, la plupart des méthodes traditionnelles de défrichement du poisson zèbre sont assez toxiques6 et donc moins souhaitable pour une utilisation.
Les techniques à base d’anticorps, telles que la FI et l’IHC, sont souvent utilisées pour détecter l’expression des protéines dans des matériaux sectionnés, simplifiant ainsi l’identification de populations cellulaires distinctes qui expriment une protéine particulière dans des tissus complexes. IHC est couramment utilisé pour la colocalisation, le plus souvent en utilisant deux anticorps différents conjugués dans différentes espèces hôtes et visualisés avec différents chromogènes colorés4,7,8,9 , 10. Cependant, l’utilisation de chromogènes multiples peut conduire à la coloration de fond non spécifique ou à l’incompatibilité des couleurs11,12.
Nous avons développé un nouveau protocole pour la détection de protéines multiples par IF séquentiel et IHC sur les embryons cryosectionnés de poissons zèbres à un stade précoce. La cryosection est particulièrement bien adaptée aux tissus délicats tels que les embryons de poissons zèbres, et les cryosections sont supérieures aux sections incorporées à la paraffine pour les essais à base de fluorescence13,14. Nous avons choisi d’optimiser la FI combinée et l’IHC plutôt que la FI bicolore ou IHC, afin de contourner le problème de l’incompatibilité des anticorps pour un seul type d’épreuve. Ces problèmes sont particulièrement pertinents pour la recherche sur le poisson zèbre en raison du nombre limité d’anticorps disponibles dans le commerce qui sont validés pour une utilisation chez le poisson zèbre. En fait, une étude de quatre grandes entreprises a montré que les anticorps disponibles dans le commerce pour une utilisation chez la souris était d’environ 112 000 contre environ 5 300 pour une utilisation chez le poisson zèbre15. Enfin, nous avons choisi de développer un protocole qui pourrait être réalisé sur une seule cryosection, ce qui est essentiel lorsque nous travaillons avec des échantillons de tissus petits ou limités tels que sont obtenus à partir d’embryons de poissons zèbres.
Ce protocole a été conçu pour évaluer le comportement proliférant des cellules donneuses dans 48 h après la fécondation des embryons de poissons zèbres chimériques qui ont été générés par la greffe blastula-à-blastula comme décrit par Carmany-Rampey et Moens16. Des embryons de donneur ont été injectés à l’étape d’une cellule avec un conjugué fluorescent de dextran avant la transplantation des cellules de distributeur dans les embryons de destinataire. Nous avons utilisé l’immunofluorescence pour Ser 10 phosphorylated Histone H3 (pH3) pour détecter les cellules proliférantes suivies par l’immunohistochimie pour le dextran étiqueté pour détecter les cellules de donneur dans les embryons de poisson zèbre chimérique. La détection séquentielle du pH3 et du dextran étiqueté dans une seule cryosection nous a permis d’identifier et de quantifier les cellules individuelles qui exprimaient les deux marqueurs.
Ce protocole séquentiel IF/IHC pour le poisson zèbre cryosectionné fournira un outil utile pour les chercheurs de poissons zèbres qui désirent un protocole de colocalisation pour l’expression des protéines. Les problèmes que ce protocole a été conçu pour résoudre, tels que les petits spécimens de tissus et la disponibilité limitée des anticorps, ne sont pas propres au modèle du poisson zèbre. Cette méthode peut donc être utile à tout chercheur désireux d’effectuer des IF/IHC séquentiels.
ÉNONCÉ D’ÉTHIQUE :
Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté une nouvelle méthode pour l’immunofluorescence combinée et l’immunohistochimie qui représente une étape importante en effectuant des expériences de colocalisation sur des embryons cryosectionnés de poisson zèbre. Il y a un manque critique de protocoles de colocalisation existants qui sont optimisés pour une utilisation avec de petits embryons et du matériel cryosectionné17,18, qui sont tous deux couramment utilisés dans les études moléculaires14. Les protocoles de colocalisation existants se concentrent principalement sur la visualisation simultanée de deux fluorophores17,18. Bien que ces protocoles puissent bien fonctionner, leur utilité est limitée par la disponibilité d’anticorps qui (i) peuvent être utilisés dans le poisson zèbre et (ii) sont compatibles avec IF.
Nous pensons que l’utilisation de la cryosection pour les embryons de poissons zèbres offre un avantage significatif en termes de morphologie des tissus préservés. Comme le CiPH est plus couramment pratiqué sur les sections de paraffine que la cryosection7,8, une exploration plus approfondie des méthodes IHC basées sur la cryosection pour la détection de l’expression des protéines est justifiée. L’utilisation de la monture entière IF est une méthode courante pour visualiser les niveaux d’expression dans les embryons de poissons zèbres, et est plus couramment décrite dans la littérature que SI en utilisant cryosections1,2,3,4, 19. Cependant, les protocoles de montage entier ont des limites, y compris l’absence de localisation précise des protéines exprimées dans les tissus profonds et le potentiel pour l’expression de niveau de surface pour obscurcir l’expression de protéine dans les tissus plus profonds. Nous avons constamment observé l’excellent entretien de la morphologie cellulaire suivant la cryoconservation, le sectionnement, et la FI et iHC séquentielles. Pour les applications qui nécessitent une localisation précise de l’expression des protéines au niveau unicellulaire, il y a un avantage significatif aux procédures basées sur la section comme nous l’avons décrit dans ce protocole. L’incorporation de résine offre une option alternative pour effectuer des tests IF ou IHC sur des sections d’embryons de poissons zèbres à un stade précoce20. Les sections de résine fournissent la conservation supérieure de la morphologie de tissu comparée aux cryosections, et des sections de tissu relativement plus minces peuvent être préparées. Cependant, les fabricants ne recommandent généralement pas l’utilisation de sections de résine pour les essais immuno-basés, car certains composants des résines ne peuvent pas être retirés des sections et peuvent masquer les sites de liaison d’anticorps21.
Bien que l’ensemble du protocole soit essentiel pour une analyse précise et réussie des modèles d’expression, quelques étapes spécifiques sont essentielles au succès expérimental. La première étape critique est la manipulation des embryons lors de l’intégration dans OCT13,14. Il peut être difficile d’orienter chaque embryon dans le même plan transversal afin que les sections soient coupées à peu près de la même zone pour tous les embryons. Nous avons constaté que l’utilisation d’aiguilles à petite jauge pour effectuer de petits mouvements délibérés à travers le milieu visqueux OCT pour l’orientation des embryons est supérieure à l’utilisation de forceps, qui sont trop grands et déplacer trop de milieu OCT. Une deuxième étape critique se produit lors de la section des blocs congelés, car il peut être difficile d’obtenir des sections de haute qualité qui contiennent le tissu désiré sans formation et expérience significatives. Nous recommandons donc l’utilisation d’échantillons d’essai jusqu’à ce que la technique soit maîtrisée. Une troisième étape critique est l’enlèvement de la feuille de couverture, qui a le potentiel de perturber ou de dépouiller les échantillons de tissus. Nous avons constaté qu’une combinaison d’agitation douce pour desserrer la glissade de couverture et le retrait lent de la glissière du récipient de PBS est l’approche la plus efficace pour enlever des couvertures. Une main douce et régulière est la meilleure; les chercheurs peuvent constater que certains essais et erreurs sont nécessaires pour apprendre à supprimer efficacement les fiches de couverture.
D’autres étapes importantes dans le protocole comprennent l’optimisation des anticorps (anticorps primaires et secondaires pour les essais IF et IHC) et l’exposition des diapositives au substrat chromogénique et à la contre-tache. Une recherche approfondie sur la spécificité des anticorps primaires et la concentration cible est essentielle; en général, il est préférable de recueillir suffisamment d’échantillons non précieux pour au moins deux expériences distinctes pour la FI et l’IHC qui seront effectuées pour optimiser les concentrations d’anticorps primaires avant de commencer la combinaison IF/IHC. L’inclusion d’un contrôle positif et négatif connu pour chaque anticorps primaire est essentielle dans chaque expérience pour s’assurer que les tests IF et IHC sont performants de manière appropriée. Des ajustements à la concentration secondaire d’anticorps peuvent également être nécessaires. L’optimisation de l’exposition des sections tissulaires au substrat chromogénique et à la contre-tache pour l’analyse du CSI est nécessaire, puisque les lignes directrices du fabricant décrivent souvent un large éventail de temps d’exposition possibles. Tous les chromogènes ne peuvent pas être compatibles avec les contre-taches et la pigmentation des tissus endogènes, ce qui nécessite une planification minutieuse en ce qui concerne la sélection des chromogènes.
Il existe de nombreuses modifications potentielles qui peuvent être appliquées au protocole décrit, et nous avons réussi ce protocole avec d’autres combinaisons d’anticorps qui ne pouvaient pas être utilisés à la fois pour IF. Comme mentionné ci-dessus, les substances chromogéniques ont une compatibilité distincte avec des contretaches spécifiques. Nous avons constaté que ces composants sont facilement modifiables dans le protocole. En outre, les paramètres d’incubation des anticorps sont assez flexibles, et peuvent être augmentés ou diminués en fonction de l’intensité de coloration désirée. Le processus d’intégration peut également être modifié. Bien que nous nous soyons concentrés sur les sections transversales, les embryons peuvent facilement être orientés dans n’importe quelle direction pour aborder des tissus particuliers d’intérêt. Enfin, il y a plusieurs points de pause possibles dans ce protocole. Les embryons déshydratés peuvent être stockés à 100% MeOH à -20 oC pendant quelques mois; les blocs congelés peuvent être entreposés à -80 oC pendant une période pouvant aller jusqu’à trois mois; et les diapositives préparées peuvent être stockées à -80 oC pendant jusqu’à neuf mois dans une boîte à glissière.
En raison de la complexité relative de ce protocole combiné IF/IHC, il existe de multiples sources possibles de variation ou d’erreur qui peuvent nécessiter un dépannage, allant de la qualité des tissus à l’expérience du chercheur en passant par la manipulation d’échantillons. La plupart des étapes critiques décrites ci-dessus sont considérées comme critiques parce qu’elles nécessitent soit une optimisation au niveau de l’utilisateur individuel, soit qu’elles nécessitent une dextérité, une compétence et une expérience particulières. Cependant, nous avons constaté que la coloration de fond non spécifique et la faible intensité du signal sont les problèmes les plus importants nécessitant une optimisation. Comme avec n’importe quel protocole de SI ou d’IHC, adresser ces issues peut être long et laborieux, et peut être composé avec cette méthode puisque les deux techniques sont combinées. Pour cette raison, nous recommandons fortement d’optimiser la FI et le CSI séparément avant de procéder au protocole combiné.
Bien que nous prédisions que cette méthode sera utile pour un large éventail d’expériences, il existe des limites potentielles. La performance réussie de cette procédure dépend du maintien d’échantillons de tissus intacts grâce à deux expériences séquentielles qui comprennent de nombreuses étapes de lavage. Pour cette raison, tous les problèmes qui surviennent lors de la section ou de la manipulation des tissus, y compris l’utilisation de diapositives plus anciennes qui peuvent avoir dégradé en qualité, limitera considérablement la capacité des chercheurs à exécuter ce protocole avec succès. Bien que les diapositives puissent être stockées à -80 oC pendant jusqu’à neuf mois, l’adhérence des tissus aux diapositives diminue avec le temps et nous avons eu le meilleur succès avec les diapositives qui sont utilisées dans un mois de préparation ou, idéalement, le lendemain. Une deuxième limitation est la faible empreinte d’embryons de poissons zèbres. Bien que nous ayons trouvé cette expérience utile pour visualiser des protéines qui sont relativement abondamment exprimées dans les embryons à un stade précoce, les protéines qui sont exprimées de façon incohérente ou à de faibles niveaux peuvent être très difficiles à capturer dans une section. Enfin, puisque le protocole utilise des cryosections de 10 à 201212 m, il est le mieux adapté à l’évaluation de l’expression des protéines dans les structures plus grandes, comme les noyaux, plutôt que pour les composants sous-cellulaires plus petits.
En résumé, notre protocole combiné IF/IHC sera avantageux pour une grande variété d’études sur des embryons de poissons zèbres à un stade précoce, et représente une innovation importante dans l’analyse précise de l’expression des protéines chez ces spécimens. Notre méthode, présentée avec succès à la figure5, permettra aux chercheurs de préserver la morphologie délicate des embryons de poissons zèbres à un stade précoce dans les cryosections tout en travaillant avec la gamme quelque peu limitée d’anticorps primaires actuellement disponibles qui sont validé pour une utilisation en FI ou IHC chez cette espèce. Ce protocole sera probablement utile pour les études menées sur d’autres espèces de poissons et d’amphibiens (p. ex. Medaka et Xenopus spp.), qui sont entravées par des limitations similaires à la disponibilité des anticorps, et qui peuvent s’appliquer aux modèles de mammifères traditionnels comme bien.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH 5K01OD021419-02 et NC State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1X phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10X phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1X PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1000 in 1x PBS for IF |
| 1X Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1X TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all–a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Macdonald, R., Guille, M. Zebrafish Immunohistochemistry. Molecular Methods in Developmental Biology. , 77-88 (1999).
- Santos, C., Pinto, M. L. Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio). Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish. PLoS One. 9 (1), (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- van der Loos, C. M. . Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , (1999).
- OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae (2007)
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy. Basic Methods in Microscopy. , (2006).
- The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Carmany-Rampey, A., Moens, C. B. Modern mosaic analysis in the zebrafish. Methods. 39, 228-238 (2006).
- Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. Mast cell development and function in the zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).
- Quan, F. B., et al. Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. PLoS One. 10 (3), (2015).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin. Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).
