الفلورة المناعية المتسلسلة والكيمياء المناعية على أجنة حمار وحشي مقطعة بالتبريد
Summary
ويبين هذا البروتوكول الفلورة المناعية المتسلسلة والكيمياء المناعية على التبريد من أجنة سمك الحمار الوحشي في المرحلة المبكرة مما يتيح إجراء تحليلات دقيقة للتوطين المشترك في مجموعات خلايا محددة.
Abstract
غالبًا ما يتطلب التحقيق في التفاعلات بين الخلايا وضع علامات منفصلة على مجموعات خلايا محددة وتوطين دقيق للبروتين. جنين حمار وحشي هو أداة ممتازة لدراسة مثل هذه التفاعلات مع نموذج في الجسم الحي. وكثيراً ما يتم تطبيق اختبارات الهيسيوتوكيميائية المناعية والمناعية في أجنة سمك الحمار الوحشي لتقييم التعبير عن البروتين. ومع ذلك، قد يكون من الصعب تحقيق رسم خرائط دقيقة للبروتينات المترجمة المشتركة في الفضاء ثلاثي الأبعاد. وبالإضافة إلى ذلك، قد تتطلب بعض الدراسات استخدام جسمين مضادين غير متوافقين مع نفس التقنية (على سبيل المثال، الأجسام المضادة 1 مناسبة فقط للكيمياء المناعية والأجسام المضادة 2 مناسبة فقط للمناعة). الغرض من الطريقة الموضحة هنا هو إجراء الفلورة المناعية المتسلسلة و / أو الكيمياء المناعية على التبريد الفردية المستمدة من أجنة حمار وحشي في مرحلة مبكرة. هنا نقوم بوصف استخدام الجولات المتسلسلة من الفلورة المناعية، والتصوير، والكيمياء المناعية، والتصوير لقسم التبريد واحد من أجل تحقيق تحديد دقيق للتعبير عن البروتين على مستوى الخلية الواحدة. هذه المنهجية مناسبة لأي دراسة في المراحل المبكرة من أجنة حمار وحشي التي تتطلب تحديد دقيق لأهداف البروتين متعددة في الخلايا الفردية.
Introduction
سمك الحمار الوحشي هو كائن حي نموذج قوي للغاية التي تستخدم حاليا عبر مجموعة واسعة من التخصصات في البحوث الطبية الحيوية. وعلى وجه الخصوص، فإن التطور الخارجي السريع والشفافية في أجنة سمك الحمار الوحشي يوفران أداة ممتازة للدراسات الحية. هنا، نقوم بوصف طريقة للفلورة المناعية المتسلسلة (IF) وتحليلات الهيسموكيميائية المناعية (IHC) لأجنة سمك الحمار الوحشي المقطعة بالتبريد. يستخدم هذا الإجراء الجديد تطبيقًا تسلسليًا لأجسامين مضادين على شريحة واحدة، مما يتيح تحديدًا دقيقًا للبروتينات المشتركة على المستوى الخلوي مع الحفاظ على أقسام الأنسجة. وهذا البروتوكول مفيد بوجه خاص للدراسات المتعلقة بنموذج سمك الحمار الوحشي، حيث تم التحقق من صحة عدد صغير نسبياً من الأجسام المضادة لاستخدامها في تطبيقات IF و/أو IHC في سمك الحمار الوحشي مقارنة بنماذج الماوس.
مراقبة التفاعلات بين الخلايا هو عنصر أساسي في العديد من الدراسات، ويمكن أن توفر رؤى رئيسية في الآليات الجزيئية العاملة على المستوى الخلوي التي تكمن وراء الأنماط الظاهرية على مستوى الكائنات الحية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يوفر تعبير البروتين معلومات حول الوظيفة الخلوية، خاصة عند فحص التعبير عن بروتينات متعددة في وقت واحد داخل الخلية (التعريب المشترك). على الرغم من أن كامل جبل IHC وIF هي تقنياتشائعة لتحليل التعبير البروتين في أجنة حمار وحشي 1،2،3،4،5،يمكن أن تكون إجراءات جبل كامل إشكالية لتحقيق بيانات التعريب المشترك الدقيق. في تجربتنا، يمكن أن يكون من الصعب التمييز بين طبقات من الأنسجة وتصور التعبير البروتين على مستوى خلية واحدة في عينات جبل كامل. قد تكون برامج التصوير غير قادرة بشكل عام على التمييز بين تلطيخ السطح مقابل تلطيخ أعمق. يمكن حجب تعبيرات البروتين غير السطحية بواسطة تعبير مستوى سطح أكثر سطوعًا، مما يؤدي إلى عدم الدقة في القياس الكمي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم أساليب إزالة أسماك الحمار الوحشي التقليدية هي شديدة السمية6 وبالتالي فهي أقل استصواباللاستخدام.
غالبًا ما تُستخدم التقنيات المستندة إلى الأجسام المضادة، مثل IF وIHC، للكشف عن التعبير عن البروتين في المواد المقطعة، مما يبسط تحديد مجموعات الخلايا المنفصلة التي تعبر عن بروتين معين داخل الأنسجة المعقدة. ويستخدم عادة IHC للتوطين المشترك، في معظم الأحيان باستخدام اثنين من الأجسام المضادة المختلفة المترافقةفي الأنواع المضيفة المختلفة وتصور مع الكروموجين اتونا مختلفة ملونة 4،7،8،9 , 10.ومع ذلك، يمكن أن يؤدي استخدام الكروموجين متعددة إلى تلطيخ خلفية غير محددة أو عدم توافق الألوان11،12.
لقد طورنا بروتوكولًا جديدًا للكشف عن بروتينات متعددة بواسطة IF المتسلسل ة وIHC على أجنة حمار وحشي في المرحلة المبكرة من التبريد. الاستئصال بالتبريد هو مناسب بشكل خاص للأنسجة الحساسة مثل أجنة حمار وحشي، والمقاطع بالتبريد متفوقة على المقاطع جزءا لا يتجزأ من البارافين للتخزين القائم على الفلورة13،14. اخترنا لتحسين IF مجتمعة وIHC بدلا من ثنائي اللون IF أو IHC، للتحايل على مشكلة عدم توافق الأجسام المضادة لنوع واحد من نوع التدقيق. وهذه المشاكل ذات صلة خاصة بالبحوث التي تنطوي على سمك الحمار الوحشي بسبب العدد المحدود من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ً التي يتم التحقق من صحتها لاستخدامها في سمك الحمار الوحشي. في الواقع، أظهرت دراسة لأربع شركات كبيرة أن الأجسام المضادة المتاحة تجاريا للاستخدام في الماوس كان حوالي 112،000 مقابل حوالي 5،300 للاستخدام في حمار وحشي15. وأخيرا، اخترنا وضع بروتوكول يمكن تنفيذه على عملية قيصرية واحدة، وهو أمر ضروري عند العمل مع عينات الأنسجة الصغيرة أو المحدودة مثل التي يتم الحصول عليها من أجنة حمار وحشي.
تم تصميم هذا البروتوكول لتقييم السلوك التكاثري للخلايا المانحة في 48 ح بعد الإخصاب أجنة حمار وحشي chimeric التي تم إنشاؤها عن طريق زرع البلاستولا إلى الانفجار كما وصفها Carmany-Rampey وMoens16. تم حقن الأجنة المانحة في مرحلة الخلية الواحدة مع متقارن ة dextran المسمى بفلورسنت قبل زرع الخلايا المانحة في الأجنة المتلقية. استخدمنا الفلورة المناعية للسير 10 الفوسفورية الهيستون H3 (pH3) للكشف عن الخلايا المتكاثرة تليها الكيمياء المناعية لdextran المسمى للكشف عن الخلايا المانحة في أجنة حمار وحشي chimeric. وقد مكننا الكشف المتسلسل عن الرقم الهيدروجيني 3 وdextran المسمى داخل قسم تبريد واحد من تحديد وتحديد مقدار الخلايا الفردية التي تعبر عن كلا العلامتين.
هذا البروتوكول المتسلسل IF/IHC لسمك الحمار الوحشي المقطع بالتبريد سيوفر أداة مفيدة للباحثين حمار وحشي الذين يرغبون في بروتوكول التعريب المشترك للتعبير عن البروتين. والمشاكل التي صمم هذا البروتوكول لمعالجتها، مثل عينات الأنسجة الصغيرة ومحدودية توافر الأجسام المضادة، ليست فريدة من نوعها لنموذج سمك الحمار الوحشي. ولذلك قد تكون هذه الطريقة من الفائدة لأي باحث يرغب في أداء IF/IHC متتابعة.
بيان الأخلاقيات:
تمت الموافقة على جميع الدراسات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها، جامعة ولاية كارولينا الشمالية، رالي، كارولاينا الشمالية، الولايات المتحدة الأمريكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قدمنا طريقة جديدة للفَعَرِمِيّة المناعية والكيمياء المناعية التي تمثل خطوة هامة إلى الأمام في إجراء تجارب التعريب المشترك على أجنة سمك الحمار الوحشي المُقسمة بالتبريد. هناك نقص خطير في بروتوكولات التعريب القائمة التي يتم تحسينها للاستخدام مع الأجنة الصغيرة والمواد المقطعة بالتبريد17،18، وكلاهما يستخدم بشكل شائع في الدراسات الجزيئية14. وتركز بروتوكولات التوطين المشترك القائمة بشكل رئيسي على التصور المتزامن لاثنين من الفلوروفور17 و18 . وفي حين أن هذه البروتوكولات يمكن أن تعمل بشكل جيد، فإن فائدتها محدودة بتوافر الأجسام المضادة التي ‘1’ يمكن استخدامها في سمك الحمار الوحشي و’2′ متوافقة مع IF.
ونحن نرى أن استخدام الاستئصال بالتبريد لأجنة حمار وحشي يوفر ميزة كبيرة من حيث مورفولوجيا الأنسجة المحفوظة. وبما أن IHC يتم إجراؤه بشكل أكثر شيوعًا في أقسام البارافين من المقاطع بالتبريد7و8،فإن هناك ما يبرر مواصلة استكشاف أساليب IHC المستندة إلى قسم التبريد للكشف عن التعبير عن البروتين. استخدام جبل كامل IF هو وسيلة شائعة لتصور مستويات التعبير في أجنة حمار وحشي، ويردوصفه أكثر شيوعا في الأدب من IF باستخدام المقاطع الجليدية 1،2،3،4، 19. ومع ذلك، فإن بروتوكولات جبل كامل لها قيود، بما في ذلك عدم وجود توطين دقيق للبروتينات المعبر عنها في الأنسجة العميقة وإمكانية التعبير عن مستوى السطح لإخفاء التعبير البروتيني في الأنسجة العميقة. لقد لاحظنا باستمرار صيانة ممتازة للمورفولوجيا الخلوية بعد الحفظ بالتبريد، والقسم، وIF وIHC المتسلسلة. بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب توطينًا دقيقًا للتعبير عن البروتين على مستوى الخلية الواحدة، هناك ميزة كبيرة للإجراءات المستندة إلى القسم كما وصفنا في هذا البروتوكول. يوفر تضمين الراتنج خيارًا بديلًا لإجراء اختبار IF أو IHC على أقسام من أجنة حمار وحشي في المرحلة المبكرة20. توفر أقسام الراتنج الحفاظ على متفوقة من مورفولوجيا الأنسجة مقارنة مع المقاطع الجليدية، ويمكن إعداد أقسام الأنسجة أرق نسبيا. ومع ذلك، فإن الشركات المصنعة عموما لا توصي باستخدام أقسام الراتنج للاختبارات المناعية، كما لا يمكن إزالة بعض مكونات الراتنجات من الأقسام وقد تخفي مواقع ربط الأجسام المضادة21.
وفي حين أن البروتوكول برمته ضروري لإجراء تحليل دقيق وناجح لأنماط التعبير، فإن بعض الخطوات المحددة حاسمة للنجاح التجريبي. الخطوة الحرجة الأولى هي التعامل مع الأجنة أثناء التضمين فيأكتوبر 13،14. يمكن أن يكون من الصعب توجيه كل جنين في نفس الطائرة العرضية بحيث يتم قطع المقاطع من نفس المنطقة تقريبا لجميع الأجنة. لقد وجدنا أن استخدام إبر قياس صغيرة لأداء حركات صغيرة ومتعمدة من خلال وسط OCT لزجة لتوجيه الجنين متفوقة على استخدام ملقط، والتي هي كبيرة جدا وتشريد الكثير من وسائل OCT. تحدث خطوة حاسمة ثانية أثناء تقسيم الكتل المجمدة، حيث أنه قد يكون من الصعب الحصول على أقسام عالية الجودة تحتوي على الأنسجة (الأنسجة) المطلوبة دون تدريب كبير وخبرة كبيرة. وبالتالي نوصي باستخدام عينات الاختبار حتى يتم إتقان هذه التقنية. والخطوة الحرجة الثالثة هي إزالة غطاء الغلاف، الذي لديه القدرة على إزعاج أو تجريد عينات الأنسجة. لقد وجدنا أن مزيج من التحريض لطيف لتخفيف غطاء وإزالة بطيئة من الشريحة من حاوية PBS هو النهج الأكثر فعالية لإزالة الأغطية. يد لطيفة وثابتة هو أفضل; قد يجد الباحثون أن بعض التجربة والخطأ ضروري لمعرفة كيفية إزالة الأغطية بشكل فعال.
وتشمل الخطوات الهامة الإضافية في البروتوكول تحسين الأجسام المضادة (الأجسام المضادة الأولية والثانوية لكل من الاختبارات IF وIHC) والتعرض للشرائح إلى الركيزة الكروموجينية والبقع المضادة. ومن الضروري إجراء بحوث شاملة بشأن خصوصية الأجسام المضادة الأولية وتركيز الهدف؛ بشكل عام، من الأفضل جمع عينات غير ثمينة كافية لتجربتين منفصلتين على الأقل لـ IF وIHC التي سيتم إجراؤها لتحسين تركيزات الأجسام المضادة الأولية قبل البدء في تركيبة IF/IHC. إن تضمين التحكم الإيجابي والسلبي المعروف لكل جسم مضاد أساسي أمر ضروري في كل تجربة لضمان أداء كل من اختبار IF وIHC بشكل مناسب. وقد يكون من الضروري أيضاً إدخال تعديلات على تركيز الأجسام المضادة الثانوي. إن الاستفادة المثلى من تعرض أقسام الأنسجة للغواصة الكروموجينية والبقع المضادة للفحص IHC مطلوب، لأن المبادئ التوجيهية للشركة المصنعة غالباً ما تصف مجموعة واسعة من أوقات التعرض المحتملة. قد لا تكون جميع الكروموجين اتّصالمع مع البقع المضادة وتصبغ الأنسجة الذاتية، مما يتطلب تخطيطاً دقيقاً فيما يتعلق باختيار الكروموجين.
هناك العديد من التعديلات المحتملة التي يمكن تطبيقها على البروتوكول الموضح، وقد قمنا بنجاح بإجراء هذا البروتوكول مع مجموعات أخرى من الأجسام المضادة التي لا يمكن استخدامها لـ IF. وكما أشير إلى ذلك أعلاه، فإن المواد الكروموجينية لها توافق واضح مع البقع المضادة المحددة. لقد وجدنا أن هذه المكونات قابلة للتعديل بسهولة في البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، فإن المعلمات لحضانة الأجسام المضادة مرنة جدا، ويمكن زيادتها أو تقليلها اعتمادا على كثافة تلطيخ المطلوب. يمكن أيضًا تعديل عملية التضمين. في حين أننا ركزنا على المقاطع العرضية، يمكن بسهولة توجيه الأجنة في أي اتجاه لمعالجة أنسجة معينة ذات أهمية. وأخيراً، هناك عدة نقاط إيقاف مؤقت ممكنة في هذا البروتوكول. يمكن تخزين الأجنة المجففة في MeOH 100٪ عند -20 درجة مئوية لبضعة أشهر. يمكن تخزين كتل المجمدة في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. ويمكن تخزين الشرائح المعدة في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى تسعة أشهر في مربع الشريحة.
نظرًا للتعقيد النسبي لهذا البروتوكول المشترك IF/IHC، هناك مصادر متعددة ممكنة للتباين أو الخطأ التي قد تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها، بدءاً من جودة الأنسجة إلى تجربة الباحث إلى معالجة العينات. تعتبر معظم الخطوات الهامة الموضحة أعلاه هامة لأنها تتطلب التحسين على مستوى المستخدم الفردي أو أنها تتطلب براعة ومهارة وخبرة معينة. ومع ذلك، وجدنا أن تلطيخ الخلفية غير المحددة وانخفاض كثافة الإشارة هي أهم القضايا التي تتطلب التحسين. كما هو الحال مع أي بروتوكول IF أو IHC، يمكن أن تكون معالجة هذه القضايا تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة، ويمكن أن تتفاقم مع هذه الطريقة منذ الجمع بين التقنيات اثنين. ولهذا السبب، نوصي بشدة بتحسين IF وIHC بشكل منفصل قبل الشروع في البروتوكول المدمج.
وفي حين أننا نتوقع أن تكون هذه الطريقة مفيدة لمجموعة واسعة من التجارب، فإن هناك قيودا محتملة. يعتمد الأداء الناجح لهذا الإجراء على الحفاظ على عينات الأنسجة السليمة من خلال تجربتين متتاليتين تتضمنان العديد من خطوات الغسيل. ولهذا السبب، فإن أي مشاكل تنشأ أثناء القسم أو مناولة الأنسجة، بما في ذلك استخدام الشرائح القديمة التي قد تكون قد تدهورت من حيث الجودة، سوف تحد بشكل كبير من قدرة الباحثين على تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح. على الرغم من أنه من المحتمل تخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى تسعة أشهر، فإن التزام الأنسجة بالشرائح ينخفض مع مرور الوقت، وكان لدينا أفضل نجاح مع الشرائح التي يتم استخدامها في غضون شهر من الإعداد أو بشكل مثالي، في اليوم التالي. والقيد الثاني هو البصمة الصغيرة لأجنة سمك الحمار الوحشي. في حين وجدنا هذه التجربة لتكون مفيدة في تصور البروتينات التي يتم التعبير عنها بوفرة نسبيا في الأجنة في مرحلة مبكرة، والبروتينات التي يتم التعبير عنها بشكل غير متسق أو على مستويات منخفضة قد يكون من الصعب جدا التقاطها في قسم. وأخيراً، بما أن البروتوكول يستخدم 10\u201212 μm cryosections، فهو الأنسب لتقييم التعبير عن البروتين في هياكل أكبر، مثل النوى، بدلاً من المكونات الفرعية الخلوية الأصغر حجماً.
وباختصار، فإن بروتوكول IF/IHC المشترك لدينا سيكون مفيدًا لمجموعة واسعة من الدراسات في أجنة حمار وحشي في المرحلة المبكرة، ويمثل ابتكارًا مهمًا في تحليل دقيق للتعبير عن البروتين في مثل هذه العينات. إن أسلوبنا، الذي يظهر بنجاح في الشكل5، سيسمح للباحثين بالحفاظ على المورفولوجيا الدقيقة لأجنة سمك الحمار الوحشي في المرحلة المبكرة في عمليات التبريد أثناء العمل مع مجموعة محدودة إلى حد ما من الأجسام المضادة الأولية المتاحة حالياً التي هي التحقق من صحتها للاستخدام في IF أو IHC في هذا النوع. ومن المرجح أن يكون هذا البروتوكول مفيداً للدراسات في الأنواع الأخرى من الأسماك والبرمائيات (مثل Medaka وXenopus spp.)، التي تعوقها قيود مماثلة لتوافر الأجسام المضادة، وقد تكون قابلة للتطبيق على نماذج الثدييات التقليدية مثل حسنا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة NIH 5K01OD021419-02 وكلية الطب البيطري بجامعة ولاية نورث كارولاينا.
Materials
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1X phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10X phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1X PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1000 in 1x PBS for IF |
| 1X Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1X TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all–a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Macdonald, R., Guille, M. Zebrafish Immunohistochemistry. Molecular Methods in Developmental Biology. , 77-88 (1999).
- Santos, C., Pinto, M. L. Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio). Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish. PLoS One. 9 (1), (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- van der Loos, C. M. . Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , (1999).
- OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae (2007)
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy. Basic Methods in Microscopy. , (2006).
- The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Carmany-Rampey, A., Moens, C. B. Modern mosaic analysis in the zebrafish. Methods. 39, 228-238 (2006).
- Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. Mast cell development and function in the zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).
- Quan, F. B., et al. Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. PLoS One. 10 (3), (2015).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin. Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).
