Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen
Summary
Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.
Abstract
Die Untersuchung interzellulärer Wechselwirkungen erfordert oft eine diskrete Kennzeichnung bestimmter Zellpopulationen und eine präzise Proteinlokalisierung. Der Zebrafisch-Embryo ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, um solche Wechselwirkungen mit einem In-vivo-Modell zu untersuchen. Ganzkörper-Immunhistochemikalien und Immunfluoreszenz-Assays werden häufig in Zebrafischembryonen angewendet, um die Proteinexpression zu bewerten. Es kann jedoch schwierig sein, eine genaue Kartierung von kolokalisierten Proteinen im dreidimensionalen Raum zu erreichen. Darüber hinaus können einige Studien die Verwendung von zwei Antikörpern erfordern, die nicht mit der gleichen Technik kompatibel sind (z. B. ist Antikörper 1 nur für die Immunhistochemie geeignet und Antikörper 2 ist nur für Immunfluoreszenz geeignet). Der Zweck der hier beschriebenen Methode ist die sequenzielle Immunfluoreszenz und/oder Immunhistochemie an einzelnen Kryosektionen, die von Zebrafischembryonen im Frühstadium abgeleitet wurden. Hier beschreiben wir die Verwendung von sequenziellen Runden der Immunfluoreszenz, Bildgebung, Immunhistochemie, Bildgebung für eine einzelne Kryosektion, um eine präzise Identifizierung der Proteinexpression auf einzelzeller Ebene zu erreichen. Diese Methode eignet sich für jede Studie an Zebrafischembryonen im Frühstadium, die eine genaue Identifizierung mehrerer Proteinziele in einzelnen Zellen erfordert.
Introduction
Der Zebrafisch ist ein extrem robuster Modellorganismus, der derzeit in den verschiedensten Disziplinen der biomedizinischen Forschung eingesetzt wird. Insbesondere die schnelle externe Entwicklung und Transluzenz von Zebrafischembryonen ist ein hervorragendes Werkzeug für In-vivo-Studien. Hierin beschreiben wir eine Methode zur sequenziellen Immunfluoreszenz (IF) und immunhistochemischen (IHC) Analysen von kryosektionierten Zebrafischembryonen. Dieses neuartige Verfahren verwendet die sequenzielle Anwendung von zwei Antikörpern auf einem einzigen Dia, was eine genaue Identifizierung von kolokalisierten Proteinen auf zellulärer Ebene ermöglicht und gleichzeitig Gewebeabschnitte konserviert. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für Studien mit dem Zebrafischmodell, da eine relativ kleine Anzahl von Antikörpern für den Einsatz in IF- und/oder IHC-Anwendungen bei Zebrafischen im Vergleich zu Mausmodellen validiert wurde.
Die Beobachtung interzellulärer Wechselwirkungen ist ein wesentliches Element in vielen Studien und kann wichtige Einblicke in molekulare Mechanismen liefern, die auf zellulärer Ebene funktionieren und Phänotypen auf Der Organismusebene zugrunde liegen. Darüber hinaus kann die Proteinexpression Informationen über die zelluläre Funktion liefern, insbesondere bei der Untersuchung der Expression mehrerer Proteine gleichzeitig innerhalb der Zelle (Kolokalisierung). Obwohl Vollmontage-IHC und IF häufig verfahren zur Analyse der Proteinexpression in Zebrafischembryonen1,2,3,4,5, ganze Mount-Verfahren für die Erzielung präziser Kolokalisierungsdaten problematisch. Unserer Erfahrung nach kann es schwierig sein, zwischen Gewebeschichten zu unterscheiden und die Proteinexpression auf einzelzeller Ebene in ganzmontierten Proben zu visualisieren. Imaging-Softwareprogramme können in der Regel nicht zwischen Oberflächenfärbung und tieferer Färbung unterscheiden. Proteinausdrücke auf Nicht-Oberflächenebene können durch heller ausgedrückte Oberflächenebenenausdrücke verdeckt werden, was zu Ungenauigkeiten bei der Quantifizierung führt. Darüber hinaus sind die meisten traditionellen Zebrafisch-Clearing-Methoden ziemlich giftig6 und daher weniger wünschenswert für den Einsatz.
Antikörperbasierte Techniken wie IF und IHC werden häufig verwendet, um die Proteinexpression in geschnittenem Material zu erkennen, was die Identifizierung diskreter Zellpopulationen vereinfacht, die ein bestimmtes Protein in komplexen Geweben ausdrücken. IHC wird häufig für die Kolokalisierung verwendet, am häufigsten durch die Verwendung von zwei verschiedenen Antikörpern konjugiert in verschiedenen Wirtsarten und visualisiert mit verschiedenen farbigen Chromogenen4,7,8,9 , 10. Die Verwendung mehrerer Chromogene kann jedoch zu unspezifischen Hintergrundfärbungen oder Inkompatibilitäten der Farben11,12führen.
Wir entwickelten ein neuartiges Protokoll zum Nachweis mehrerer Proteine durch sequenzielle IF und IHC an kryosectionierten Zebrafischembryonen im Frühstadium. Kryosektionen eignen sich besonders gut für empfindliche Gewebe wie Zebrafischembryonen, und Kryosektionen sind Paraffin-eingebetteten Abschnitten für Fluoreszenz-basierte Assays13,14überlegen. Wir haben uns dafür entschieden, kombinierte IF und IHC anstelle von zweifarbigen IF oder IHC zu optimieren, um das Problem der Antikörperinkompatibilität für einen einzelnen Assay-Typ zu umgehen. Diese Probleme sind besonders relevant für die Forschung mit Zebrafischen aufgrund der begrenzten Anzahl kommerziell erhältlicher Antikörper, die für den Einsatz in Zebrafischen validiert sind. Tatsächlich zeigte eine Studie von vier großen Unternehmen, dass kommerziell erhältliche Antikörper für den Einsatz in der Maus etwa 112.000 gegenüber etwa 5.300 für den Einsatz in Zebrafischen15betrugen. Schließlich haben wir uns für die Entwicklung eines Protokolls entschieden, das auf einer einzigen Kryosektion durchgeführt werden könnte, was bei der Arbeit mit kleinen oder begrenzten Gewebeproben, wie sie von Zebrafischembryonen gewonnen werden, unerlässlich ist.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das proliferative Verhalten von Spenderzellen in 48 h chimieren Zebrafischembryonen nach der Befruchtung zu bewerten, die durch Blastula-zu-Blastula-Transplantation erzeugt wurden, wie von Carmany-Rampey und Moens16beschrieben. Spenderembryonen wurden im Einzellstadium mit einem fluoreszierend gekennzeichneten Dextran-Konjugat injiziert, bevor Spenderzellen in Empfängerembryonen transplantiert wurden. Wir verwendeten Immunfluoreszenz für Ser 10 phosphorylierten Histon H3 (pH3), um vermehrende Zellen zu detektieren, gefolgt von Immunhistochemie für den markierten Dextran, um Spenderzellen in chimären Zebrafischembryonen zu erkennen. Die sequenzielle Detektion von pH3 und dem beschrifteten Dextran innerhalb eines einzigen Kryoabschnitts ermöglichte es uns, einzelne Zellen zu identifizieren und zu quantifizieren, die beide Marker exprimierten.
Dieses sequenzielle IF/IHC-Protokoll für kryosectioned Zebrafish wird ein nützliches Werkzeug für Zebrafischforscher sein, die ein Kolokalisierungsprotokoll für die Proteinexpression wünschen. Die Probleme, die dieses Protokoll angehen sollte, wie kleine Gewebeproben und begrenzte Antikörperverfügbarkeit, sind nicht nur für das Zebrafischmodell bestimmt. Diese Methode kann daher für jeden Forscher von Nutzen sein, der sequenzielleIFielleIFe IF/IHC durchführen möchte.
ETHICS STATEMENT:
Alle Tierstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA genehmigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine neuartige Methode für kombinierte Immunfluoreszenz und Immunhistochemie vorgestellt, die einen wichtigen Schritt nach vorn bei der Durchführung von Kolokalisierungsexperimenten an kryosektionierten Zebrafischembryonen darstellt. Es gibt einen kritischen Mangel an bestehenden Kolokalisierungsprotokollen, die für die Verwendung mit kleinen Embryonen und kryosectioniertem Material17,18optimiert sind, die beide sonst häufig in molekularen Studien verwendet werden14. Bestehende Kolokalisierungsprotokolle konzentrieren sich hauptsächlich auf die gleichzeitige Visualisierung von zwei Fluorophoren17,18. Obwohl diese Protokolle gut funktionieren können, wird ihre Nützlichkeit durch die Verfügbarkeit von Antikörpern eingeschränkt, die (i) in Zebrafischen verwendet werden können und (ii) mit IF kompatibel sind.
Wir sind der Meinung, dass die Verwendung von Kryosektionen für Zebrafischembryonen einen signifikanten Vorteil in Bezug auf die konservierte Gewebemorphologie bietet. Da IHC häufiger auf Paraffinabschnitten als Kryosections7,8durchgeführt wird, ist eine weitere Erforschung von Kryosektions-basierten IHC-Methoden zum Nachweis der Proteinexpression gerechtfertigt. Die Verwendung von ganzer Halterung IF ist eine gängige Methode zur Visualisierung von Expressionsniveaus in Zebrafischembryonen und wird in der Literatur häufiger beschrieben als IF mit Kryosektionen1,2,3,4, 19. Allerdings haben ganze Mount-Protokolle Grenzen, einschließlich des Mangels an genauer Lokalisierung von Proteinen, die in tiefen Geweben exprimiert werden, und des Potenzials für eine Expression auf Oberflächenebene, um die Proteinexpression in tieferen Geweben zu verschleiern. Wir haben konsequent eine ausgezeichnete Wartung der zellulären Morphologie nach Kryokonservierung, Schnitt und sequenzielleife IF und IHC beobachtet. Bei Anwendungen, die eine präzise Lokalisierung der Proteinexpression auf einzelzeller Ebene erfordern, hat dies einen erheblichen Vorteil für abschnittsbasierte Verfahren, wie wir sie in diesem Protokoll beschrieben haben. Die Harzeinbettung bietet eine alternative Option für if- oder IHC-Assays an Abschnitten von Zebrafischembryonen im Frühstadium20. Harzabschnitte bieten eine überlegene Konservierung der Gewebemorphologie im Vergleich zu Kryosektionen, und relativ dünnere Gewebeabschnitte können vorbereitet werden. Die Hersteller empfehlen jedoch generell nicht die Verwendung von Harzprofilen für immunbasierte Assays, da einige Komponenten der Harze nicht aus den Abschnitten entfernt werden können und Antikörperbindungsstellen maskieren können21.
Während das gesamte Protokoll für eine genaue und erfolgreiche Analyse von Ausdrucksmustern unerlässlich ist, sind einige spezifische Schritte entscheidend für den experimentellen Erfolg. Der erste kritische Schritt ist der Umgang mit Embryonen während der Einbettung in OCT13,14. Es kann schwierig sein, jeden Embryo in der gleichen Querebene so auszurichten, dass Abschnitte aus etwa der gleichen Fläche für alle Embryonen geschnitten werden. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung kleiner Nadeln, um kleine, absichtliche Bewegungen durch das viskose OCT-Medium zur Embryoorientierung durchzuführen, besser ist als die Verwendung von Zangen, die zu groß sind und zu viel OCT-Medium verdrängen. Ein zweiter kritischer Schritt tritt beim Schnitt von gefrorenen Blöcken auf, da es schwierig sein kann, hochwertige Abschnitte zu erhalten, die das gewünschte Gewebe enthalten, ohne signifikante Sanierung und Erfahrung. Wir empfehlen daher die Verwendung von Testproben, bis die Technik gemeistert ist. Ein dritter kritischer Schritt ist die Abdeckungsrutschentfernung, die das Potenzial hat, Gewebeproben zu stören oder abzustreifen. Wir haben festgestellt, dass eine Kombination aus sanfter Rührung zum Lösen des Deckels und dem langsamen Entfernen des Schlittens aus dem PBS-Behälter der effektivste Ansatz zum Entfernen von Abdeckungen ist. Eine sanfte und ruhige Hand ist am besten; Forscher können feststellen, dass einige Versuch und Fehler notwendig ist, um zu lernen, wie man Abdeckungen effektiv zu entfernen.
Weitere wichtige Schritte im Protokoll sind die Optimierung von Antikörpern (primäre und sekundäre Antikörper für IF- und IHC-Assays) und die Exposition von Dias gegenüber dem chromogenen Substrat und Gegenfleck. Eine gründliche Forschung in Bezug auf primäre Antikörperspezifität und Zielkonzentration ist von wesentlicher Bedeutung; Im Allgemeinen ist es am besten, genügend nicht-edelproben für mindestens zwei separate Experimente für IF und IHC zu sammeln, die durchgeführt werden, um primäre Antikörperkonzentrationen zu optimieren, bevor die IF/IHC-Kombination beginnt. Die Einbeziehung einer bekannten positiven und negativen Kontrolle für jeden primären Antikörper ist in jedem Experiment unerlässlich, um sicherzustellen, dass sowohl IF- als auch IHC-Assays angemessen funktionieren. Anpassungen der sekundären Antikörperkonzentration können ebenfalls erforderlich sein. Eine Optimierung der Exposition von Gewebeabschnitten gegenüber dem chromogenen Substrat und Gegenfleck für den IHC-Test ist erforderlich, da Herstellerrichtlinien oft eine Vielzahl möglicher Expositionszeiten beschreiben. Nicht alle Chromogene sind möglicherweise mit Gegenflecken und endogener Gewebepigmentierung kompatibel, was eine sorgfältige Planung in Bezug auf die Chromogenauswahl erfordert.
Es gibt zahlreiche mögliche Modifikationen, die auf das beschriebene Protokoll angewendet werden können, und wir haben dieses Protokoll erfolgreich mit anderen Kombinationen von Antikörpern durchgeführt, die nicht beide für IF verwendet werden konnten. Wie bereits erwähnt, weisen chromogene Stoffe eine ausgeprägte Verträglichkeit mit spezifischen Gegenflecken auf. Wir haben festgestellt, dass diese Komponenten im Protokoll leicht veränderbar sind. Darüber hinaus sind die Parameter für die Antikörperinkubation recht flexibel und können je nach gewünschter Färbeintensität erhöht oder verringert werden. Der Einbettungsprozess kann ebenfalls geändert werden. Während wir uns auf Querabschnitte konzentriert haben, können Embryonen leicht in jede Richtung ausgerichtet werden, um bestimmte Gewebe von Interesse anzusprechen. Schließlich gibt es mehrere mögliche Pausenpunkte in diesem Protokoll. Dehydrierte Embryonen können in 100% MeOH bei -20 °C für einige Monate gelagert werden; gefrorene Blöcke können bis zu drei Monate bei -80 °C gelagert werden; und vorbereitete Dias können bei -80 °C bis zu neun Monate in einer Diabox gelagert werden.
Aufgrund der relativen Komplexität dieses kombinierten IF/IHC-Protokolls gibt es mehrere mögliche Variations- oder Fehlerquellen, die eine Fehlerbehebung erfordern können, von der Gewebequalität über die Erfahrung von Forschern bis hin zur Probenhandhabung. Die meisten der oben beschriebenen kritischen Schritte werden als kritisch betrachtet, da sie entweder eine Optimierung auf der ebenerdigen Benutzerebene erfordern oder eine besondere Geschicklichkeit, Fertigkeit und Erfahrung erfordern. Wir haben jedoch festgestellt, dass unspezifische Hintergrundfärbung und niedrige Signalintensität die wichtigsten Probleme sind, die optimiert werden müssen. Wie bei jedem IF- oder IHC-Protokoll kann die Behandlung dieser Probleme zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein und kann mit dieser Methode kombiniert werden, da die beiden Techniken kombiniert werden. Aus diesem Grund empfehlen wir dringend, IF und IHC separat zu optimieren, bevor Sie mit dem kombinierten Protokoll fortfahren.
Während wir vorhersagen, dass diese Methode für eine breite Palette von Experimenten nützlich sein wird, gibt es potenzielle Einschränkungen. Die erfolgreiche Durchführung dieses Verfahrens hängt von der Aufrechterhaltung intakter Gewebeproben durch zwei sequenzielle Experimente ab, die zahlreiche Waschschritte umfassen. Aus diesem Grund werden alle Probleme, die während der Schnitt- oder Gewebehandhabung auftreten, einschließlich der Verwendung älterer Dias, die in der Qualität beeinträchtigt haben, die Fähigkeit der Forscher, dieses Protokoll erfolgreich durchzuführen, erheblich einschränken. Obwohl Dias möglicherweise bis zu neun Monate bei -80 °C gelagert werden können, nimmt die Gewebehaftung an Dias im Laufe der Zeit ab und wir hatten den besten Erfolg mit Dias, die innerhalb eines Monats nach der Vorbereitung oder idealerweise am nächsten Tag verwendet werden. Eine zweite Einschränkung ist der geringe Fußabdruck von Zebrafischembryonen. Während wir dieses Experiment für nützlich bei der Visualisierung von Proteinen gefunden haben, die relativ häufig in Embryonen im Frühstadium exprimiert werden, können Proteine, die inkonsistent oder auf niedrigem Niveau exprimiert werden, in einem Abschnitt sehr schwierig zu erfassen sein. Da das Protokoll 10-u201212-M-Kryosections verwendet, eignet es sich am besten für die Bewertung der Proteinexpression in größeren Strukturen, wie Z. B. Kernen, anstatt kleinerer subzellulärer Komponenten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser kombiniertes IF/IHC-Protokoll für eine Vielzahl von Studien an Zebrafischembryonen im Frühstadium von Vorteil sein wird und eine wichtige Innovation bei der präzisen Proteinexpressionsanalyse in solchen Proben darstellt. Unsere Methode, die in Abbildung 5erfolgreich gezeigt wird, wird es den Forschern ermöglichen, die delikate Morphologie von Zebrafischembryonen im Frühstadium in Kryosektionen zu erhalten, während sie mit dem etwas begrenzten Bereich der derzeit verfügbaren Primärantikörper arbeiten, die für die Verwendung in IF oder IHC bei dieser Art validiert. Dieses Protokoll wird wahrscheinlich für Studien an anderen Fisch- und Amphibienarten (z. B. Medaka und Xenopus spp.) nützlich sein, die durch ähnliche Beschränkungen der Verfügbarkeit von Antikörpern behindert werden und für traditionelle Säugetiermodelle als brunnen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium 5K01OD021419-02 und das NC State University College of Veterinary Medicine unterstützt.
Materials
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1X phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10X phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1X PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1000 in 1x PBS for IF |
| 1X Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1X TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
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