Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione
Summary
Questo protocollo dimostra l’immunofluorescenza sequenziale e l’immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.
Abstract
Lo studio delle interazioni intercellulari spesso richiede un’etichettatura discreta di specifiche popolazioni cellulari e una localizzazione precisa delle proteine. L’embrione di pesce zebra è un ottimo strumento per esaminare tali interazioni con un modello in vivo. I saggi immunohisofalici e immunofluorescenza a montaggio intero sono spesso applicati negli embrioni di pesce zebra per valutare l’espressione proteica. Tuttavia, può essere difficile ottenere una mappatura accurata delle proteine co-localizzate nello spazio tridimensionale. Inoltre, alcuni studi possono richiedere l’uso di due anticorpi non compatibili con la stessa tecnica (ad esempio, l’anticorpo 1 è adatto solo per l’immunohistochimica e l’anticorpo 2 è adatto solo per l’immunofluorescenza). Lo scopo del metodo qui descritto è quello di eseguire l’immunofluorescenza sequenziale e/o l’immunohistochimica su criosezioni individuali derivate da embrioni di pesce zebra in fase iniziale. Qui descriviamo l’uso di cicli sequenziali di immunofluorescenza, imaging, immunohistochimica, imaging per una singola criosezione al fine di ottenere un’identificazione precisa dell’espressione proteica a livello di singola cellula. Questa metodologia è adatta per qualsiasi studio sugli embrioni di pesce zebra in fase iniziale che richiede l’identificazione accurata di più bersagli proteici nelle singole cellule.
Introduction
Il pesce zebra è un organismo modello estremamente robusto che è attualmente utilizzato in un’ampia varietà di discipline nella ricerca biomedica. In particolare, il rapido sviluppo esterno e la traslucenza degli embrioni di pesce zebra forniscono uno strumento eccellente per gli studi in vivo. Qui, descriviamo un metodo per l’immunofluorescenza sequenziale (IF) e le analisi immunostochimiche (IHC) di embrioni di pesce zebra criosezione. Questa nuova procedura utilizza l’applicazione sequenziale di due anticorpi su un singolo vetrino, consentendo l’identificazione accurata delle proteine colocalizzate a livello cellulare conservando le sezioni di tessuto. Questo protocollo è particolarmente utile per gli studi con il modello di pesce zebra, poiché un numero relativamente piccolo di anticorpi è stato convalidato per l’uso nelle applicazioni IF e/o IHC nel pesce zebra rispetto ai modelli murini.
L’osservazione delle interazioni intercellulari è un elemento essenziale in molti studi e può fornire informazioni chiave sui meccanismi molecolari che funzionano a livello cellulare che sono alla base dei fenotipi a livello di organismo. Inoltre, l’espressione proteica può fornire informazioni sulla funzione cellulare, specialmente quando si esamina l’espressione di più proteine contemporaneamente all’interno della cellula (co-localizzazione). Sebbene IHC e IF siano tecniche comunemente utilizzate per l’analisi dell’espressione proteica negli embrioni di pesce zebra1,2,3,4,5, le procedure di montaggio intero possono essere problematico per ottenere dati di co-localizzazione precisi. Nella nostra esperienza, può essere difficile distinguere tra strati di tessuto e visualizzare l’espressione proteica a livello di singola cellula in campioni di montaggio intero. I programmi software di imaging potrebbero generalmente non essere in grado di distinguere tra colorazione superficiale e colorazione più profonda. Le espressioni proteiche di livello non superficiale possono essere oscurate da un’espressione del livello della superficie più brillante, che porta a imprecisioni nella quantificazione. Inoltre, la maggior parte dei metodi tradizionali di compensazione dei pesci zebra sono abbastanza tossici6 e quindi meno desiderabili per l’uso.
Le tecniche basate sugli anticorpi, come IF e IHC, sono spesso utilizzate per rilevare l’espressione proteica nel materiale sezionato, semplificando l’identificazione di popolazioni di cellule discrete che esprimono una particolare proteina all’interno di tessuti complessi. IHC è comunemente usato per la colocalizzazione, più frequentemente utilizzando due diversi anticorpi coniugati in diverse specie ospiti e visualizzati con diversi cromogeni colorati4,7,8,9 , 10. Tuttavia, l’utilizzo di più cromogeni può portare a colorazione di sfondo non specifica o incompatibilità dei colori11,12.
Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per la rilevazione di più proteine mediante IF e IHC sequenziali sugli embrioni di pesce zebra criosezione in fase iniziale. La criosezione è particolarmente adatta a tessuti delicati come gli embrioni di pesce zebra, e le criosezioni sono superiori alle sezioni incorporate in paraffina per i saggi a base di fluorescenza13,14. Abbiamo scelto di ottimizzare IF e IHC combinati piuttosto che SE o IHC a doppio colore, per aggirare il problema dell’incompatibilità degli anticorpi per un singolo tipo di analisi. Questi problemi sono particolarmente rilevanti per la ricerca che coinvolge il pesce zebra a causa del numero limitato di anticorpi disponibili in commercio che vengono convalidati per l’uso nel pesce zebra. Infatti, uno studio condotto su quattro grandi aziende ha mostrato che gli anticorpi disponibili in commercio per l’uso nel mouse erano circa 112.000 contro circa 5.300 per l’uso nel pesce zebra15. Infine, abbiamo scelto di sviluppare un protocollo che potesse essere eseguito su una singola criosezione, che è essenziale quando si lavora con campioni di tessuto piccoli o limitati come si ottengono da embrioni di pesce zebra.
Questo protocollo è stato progettato per valutare il comportamento proliferativo delle cellule donatrici in 48 h dopo la fecondazione embrioni di zebra chimetrici che sono stati generati dal trapianto di blastula-to-blastula come descritto da Carmany-Rampey e Moens16. Gli embrioni del donatore sono stati iniettati nello stadio a una cellula con un coniugato dextran con etichetta fluorescente prima del trapianto di cellule donatrici in embrioni ricvenuto. Abbiamo usato l’immunofluorescenza per Ser 10 fosforolato Histone H3 (pH3) per rilevare le cellule che proliferano seguite dall’immunostochimica per la dextran etichettata per rilevare le cellule del donatore negli embrioni di pesce zebra chihimeric. Il rilevamento sequenziale del pH3 e del dextran etichettato all’interno di una singola criosezione ci ha permesso di identificare e quantificare le singole cellule che esprimevano entrambi i marcatori.
Questo protocollo sequenziale IF/IHC per il pesce zebra criosezione fornirà uno strumento utile per i ricercatori di pesci zebra che desiderano un protocollo di co-localizzazione per l’espressione delle proteine. I problemi che questo protocollo è stato progettato per affrontare, come piccoli campioni di tessuto e limitata disponibilità di anticorpi, non sono unici per il modello di pesce zebra. Questo metodo può quindi essere utile a qualsiasi ricercatore che desidera eseguire sequenziale IF/IHC.
DICHIARAZIONE ETICA:
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato un nuovo metodo per l’immunofluorescenza combinata e l’immunohistochimica che rappresenta un importante passo avanti nell’esecuzione di esperimenti di colocalizzazione sugli embrioni di pesce zebra criosezione. C’è una mancanza critica di protocolli di co-localizzazione esistenti che sono ottimizzati per l’uso con piccoli embrioni e materiale criosezione17,18, entrambi altrimenti comunemente utilizzati negli studi molecolari14. I protocolli di colocalizzazione esistenti si concentrano principalmente sulla visualizzazione simultanea di due fluorofori17,18. Mentre questi protocolli possono funzionare bene, la loro utilità è limitata dalla disponibilità di anticorpi che (i) possono essere utilizzati nel pesce zebra e (ii) sono compatibili con if.
Riteniamo che l’uso della criosezione per gli embrioni di pesce zebra offra un vantaggio significativo in termini di morfologia dei tessuti conservati. Poiché l’IHC è più comunemente eseguito su sezioni di paraffina rispetto alle criosezioni7,8, è giustificata un’ulteriore esplorazione dei metodi IHC basati sulla criosezione per il rilevamento dell’espressione proteica. L’uso dell’intero monte IF è un metodo comune per visualizzare i livelli di espressione negli embrioni di pesce zebra ed è più comunemente descritto nella letteratura rispetto a IF utilizzando criosezioni1,2,3,4, 19. Tuttavia, i protocolli di montaggio completo hanno limitazioni, tra cui la mancanza di una localizzazione accurata delle proteine espressa nei tessuti profondi e il potenziale di espressione del livello superficiale per oscurare l’espressione proteica nei tessuti più profondi. Abbiamo costantemente osservato un’eccellente manutenzione della morfologia cellulare dopo la crioconservazione, la sezionamento e l’IF e L’IHC sequenziali. Per le applicazioni che richiedono una localizzazione precisa dell’espressione proteica a livello di singola cellula, c’è un vantaggio significativo per le procedure basate sulla sezione, come abbiamo descritto in questo protocollo. L’incorporamento di resine offre un’opzione alternativa per eseguire analisi IF o IHC su sezioni di embrioni di pesce zebra in fase iniziale20. Le sezioni di resina forniscono una conservazione superiore della morfologia dei tessuti rispetto alle criosezioni e possono essere preparate sezioni di tessuto relativamente più sottili. Tuttavia, i produttori generalmente non raccomandano l’uso di sezioni di resina per saggi immuno-based, poiché alcuni componenti delle resine non possono essere rimossi dalle sezioni e possono mascherare i siti di legame degli anticorpi21.
Sebbene l’intero protocollo sia essenziale per un’analisi accurata e proficua dei modelli di espressione, alcuni passaggi specifici sono fondamentali per il successo sperimentale. Il primo passo critico è la gestione degli embrioni durante l’incorporamento in OCT13,14. Può essere difficile orientare ogni embrione nello stesso piano trasversale in modo che le sezioni vengano tagliate approssimativamente dalla stessa area per tutti gli embrioni. Abbiamo scoperto che l’utilizzo di aghi di piccolo calibro per eseguire piccoli movimenti intenzionali attraverso il viscoso mezzo dello OCT per l’orientamento embrionale è superiore all’uso di pinze, che sono troppo grandi e sposto troppo medio OCT. Un secondo passaggio critico si verifica durante la sezionamento di blocchi congelati, in quanto può essere difficile ottenere sezioni di alta qualità che contengono i tessuti desiderati senza formazione ed esperienza significativi. Si consiglia quindi l’uso di campioni di prova fino a quando la tecnica è padroneggiata. Un terzo passo critico è la rimozione di coverslip, che ha il potenziale di disturbare o rimuovere campioni di tessuto. Abbiamo scoperto che una combinazione di agitazione delicata per allentare il coperchio e la lenta rimozione del vetrino dal contenitore PBS è l’approccio più efficace per rimuovere i copricoperture. Una mano dolce e ferma è la cosa migliore; i ricercatori possono scoprire che alcuni tentativi ed errori sono necessari per imparare a rimuovere i copricopertine in modo efficace.
Ulteriori passaggi importanti nel protocollo includono l’ottimizzazione degli anticorpi (anticorpi primari e secondari per i saggi IF e IHC) e l’esposizione dei vetrini al substrato cromogenico e alla controtendenza. Una ricerca approfondita sulla specificità primaria degli anticorpi e sulla concentrazione degli obiettivi è essenziale; in generale, è meglio raccogliere sufficienti campioni non preziosi per almeno due esperimenti separati per IF e IHC che verranno eseguiti per ottimizzare le concentrazioni di anticorpi primari prima di iniziare la combinazione IF/IHC. Includere un controllo positivo e negativo noto per ogni anticorpo primario è essenziale in ogni esperimento per garantire che i test IF e IHC funzionino in modo appropriato. Possono anche essere necessarie modifiche alla concentrazione secondaria degli anticorpi. È necessaria l’ottimizzazione dell’esposizione delle sezioni tissutali al substrato cromogenico e alla controvendita per il saggio IHC, poiché le linee guida del produttore spesso descrivono una vasta gamma di possibili tempi di esposizione. Non tutti i cromogeni possono essere compatibili con le contro-ine endogeni e la pigmentazione del tessuto endogeno, richiedendo un’attenta pianificazione per quanto riguarda la selezione dei cromogeni.
Ci sono numerose potenziali modifiche che possono essere applicate al protocollo descritto, e abbiamo eseguito con successo questo protocollo con altre combinazioni di anticorpi che non potevano essere entrambi utilizzati per IF. Come accennato all’alto, le sostanze cromogeniche hanno una netta compatibilità con controstains specifici. Abbiamo scoperto che questi componenti sono facilmente modificabili nel protocollo. Inoltre, i parametri per l’incubazione degli anticorpi sono abbastanza flessibili e possono essere aumentati o diminuiti a seconda dell’intensità di colorazione desiderata. Il processo di incorporamento può anche essere modificato. Mentre ci siamo concentrati su sezioni trasversali, gli embrioni possono essere facilmente orientati in qualsiasi direzione per affrontare particolari tessuti di interesse. Infine, ci sono più possibili punti di pausa in questo protocollo. Gli embrioni disidratati possono essere conservati in 100% MeOH a -20 gradi centigradi per alcuni mesi; i blocchi congelati possono essere conservati a -80 gradi centigradi per un massimo di tre mesi; e i vetrini preparati possono essere conservati a -80 gradi centigradi per un massimo di nove mesi in una scatola di diapositive.
A causa della relativa complessità di questo protocollo IF/IHC combinato, ci sono più possibili fonti di variazione o errore che possono richiedere la risoluzione dei problemi, che vanno dalla qualità dei tessuti all’esperienza del ricercatore alla gestione del campione. La maggior parte dei passaggi critici descritti in precedenza sono considerati critici perché richiedono l’ottimizzazione a livello di singolo utente o richiedono particolare destrezza, abilità ed esperienza. Tuttavia, abbiamo scoperto che la colorazione dello sfondo non specifico e la bassa intensità del segnale sono i problemi più significativi che richiedono l’ottimizzazione. Come con qualsiasi protocollo IF o IHC, affrontare questi problemi può richiedere molto tempo e laboriosa e può essere combinato con questo metodo poiché le due tecniche sono combinate. Per questo motivo, consigliamo vivamente di ottimizzare SE e IHC separatamente prima di procedere con il protocollo combinato.
Mentre prevediamo che questo metodo sarà utile per una vasta gamma di esperimenti, ci sono potenziali limitazioni. Il successo delle prestazioni di questa procedura dipende dal mantenimento di campioni di tessuto intatti attraverso due esperimenti sequenziali che includono numerose fasi di lavaggio. Per questo motivo, eventuali problemi che sorgono durante la sezionamento o la movimentazione dei tessuti, compreso l’uso di diapositive più vecchie che potrebbero essersi degradati in qualità, limiteranno significativamente la capacità dei ricercatori di eseguire questo protocollo con successo. Anche se i vetrini possono potenzialmente essere conservati a -80 gradi centigradi per un massimo di nove mesi, l’aderenza ai vetrini diminuisce nel tempo e abbiamo avuto il miglior successo con diapositive che vengono utilizzate entro un mese dalla preparazione o idealmente, il giorno successivo. Una seconda limitazione è la piccola impronta degli embrioni di pesce zebra. Anche se abbiamo scoperto che questo esperimento è utile per la visualizzazione delle proteine che sono relativamente abbondanti mente espresse in embrioni in fase iniziale, le proteine che vengono espresse in modo incoerente o a bassi livelli possono essere molto difficili da catturare in una sezione. Infine, dal momento che il protocollo utilizza criosezioni da 10-u201212 m, è più adatto per la valutazione dell’espressione proteica in strutture più grandi, come i nuclei, piuttosto che componenti subcellulari più piccoli.
In sintesi, il nostro protocollo combinato IF/IHC sarà vantaggioso per un’ampia varietà di studi sugli embrioni di pesce zebra in fase iniziale e rappresenta un’importante innovazione nell’analisi precisa dell’espressione proteica in tali campioni. Il nostro metodo, illustrato con successo nella Figura5, consentirà ai ricercatori di preservare la delicata morfologia degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale nelle criosezioni, mentre si lavora con la gamma piuttosto limitata di anticorpi primari attualmente disponibili che sono convalidati per l’uso in IF o IHC in questa specie. Questo protocollo sarà probabilmente utile per studi condotti su altre specie di pesci e anfibi (ad esempio, Medaka e Xenopus spp.), che sono ostacolati da limitazioni simili alla disponibilità di anticorpi e possono essere applicabili ai modelli di mammiferi tradizionali bene.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH 5K01OD021419-02 e dal NC State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1X phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10X phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1X PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1000 in 1x PBS for IF |
| 1X Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1X TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
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