זיהוי חומצת אמינו מפיקי יתר באמצעות נדירים-Codon-מסמנים עשירים
Summary
מחקר זה מציג אסטרטגיה חלופית לשיטה הקונבנציונלית הרעילה האנטי-אנלוגית בזיהוי מפיקי מיתר של חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-מאוד עשירים להשגת דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו זמנית.
Abstract
כדי לספק את השוק הצומח אי פעם עבור חומצות אמינו, זנים הייצור ביצועים גבוהים נחוצים. חומצות אמינו מפיקים מאוד מזוהים על ידי רתימת התחרויות בין חומצות אמינו לבין האנלוגיות שלהם. עם זאת, שיטה מבוססת-אנלוגי זו היא בדיוק נמוכה, והאנלוגי המתאים לחומצות אמינו ספציפיות מוגבל. כאן, אנו מציגים אסטרטגיה חלופית המאפשרת הקרנת מדויק, רגיש, תפוקה גבוהה של יצרני מיתר חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-העשירים. אסטרטגיה זו היא בהשראת התופעה של הטיית השימוש של קודון בתרגום חלבונים, אשר מסווגים ביניהם לבין הנפוצים או נדירים מבוסס על התדרים שלהם של התרחשות ה-DNA קידוד. התרגום של מגנטים נדירים תלוי ב-rnas המקביל (trnas) נדיר שלהם, אשר לא ניתן לטעון במלואה על ידי חומצות אמינו קנצוני מתחת לרעב. באופן תיאורטי, tRNAs נדיר יכול להיות מחויב אם יש עודף של חומצות אמינו לאחר הטעינה של איזומקובלים משותפים נרדף. לכן, תרגומים מפגרים הנגרמים על ידי הקודונים נדירים יכולים להיות משוחזרים על ידי האכלה או הפקות יתר של חומצות האמינו המתאימות. תחת הנחה זו, מערכת בחירה או סינון לזיהוי מפיקי חומצות אמינו מוקמת על ידי החלפת הפחם המשותף של חומצות אמינו ממוקדות עם חלופות נדירות שלהם נרדף גנים עמידות לאנטיביוטיקה או את הגנים הצפנה או חלבונים כרומוגניים. אנו מראים כי ביטויי החלבון יכולים להיות מאוד מפריע בשילוב של הידרודונים נדירים וכי רמות החלבונים לתאם באופן חיובי עם ריכוזי חומצת אמינו. באמצעות מערכת זו, יצרני יתר של חומצות אמינו מרובות יכול להיות מוקרן בקלות מספריות מוטציה. האסטרטגיה הנדירה המבוססת על המחשב מחייבת רק גן אחד שהשתנה, והמארח פחות סביר להימלט מהבחירה מאשר בשיטות אחרות. הוא מציע גישה חלופית להשגת מפיקי יתר של חומצות אמינו.
Introduction
הייצור הנוכחי של חומצות אמינו מסתמך בכבדות על תסיסה. עם זאת, מגדל ותשואות עבור רוב חומצות אמינו זנים הייצור הם מתחת הדרישות העולות של שוק חומצות אמינו גלובלי כי הוא שווה מיליארדי דולרים1,2. קבלת ביצועים גבוהים חומצת אמינו מפיקי הם קריטיים לשדרוג תעשיית חומצת האמינו.
אסטרטגיה מסורתית לזיהוי מפיקי חומצת אמינו מנצלת את התחרויות בין חומצות אמינו לבין האנלוגיות שלהם בסינתזה החלבונים3,4. אנלוגיות אלה מסוגלים לחייב את tRNAs כי להכיר את חומצות אמינו המקביל ובכך לעכב את elongations של רשתות פפטיד, המוביל הצמיחה נעצר או מוות התאים5. דרך אחת להתנגד הלחצים האנלוגיים היא להגביר את ריכוזי חומצות אמינו תאיים. חומצות האמינו המועשרת יתחרו את האנלוגיות עבור tRNAs הסופיים ויבטיחו את הסינתזה הנכונה של חלבונים פונקציונליים. לכן, זנים השורדים את האנלוגיות ניתן לבחור ונוטים להיות מפיקי היתר של חומצות האמינו המתאימות.
למרות שהוא הצליח להצליח בבחירת יצרני מיתר עבור חומצות אמינו כגון L-leucine6, האסטרטגיה מבוסס אנלוגי סובל מחסרונות חמורים. דאגה אחת גדולה היא ההתנגדות האנלוגית מקורו בתהליך של מוטגנזה או באמצעות מוטציות ספונטניות. זנים עם התנגדות יכול להימלט מהבחירה על ידי חסימת, ייצוא, או משפיל את האנלוגיות5. דאגה נוספת היא תופעות הלוואי הרעילות של האנלוגיות על תהליכים סלולריים אחרים7. כתוצאה מכך, זנים השורדים את הבחירה האנלוגית לא יכול להיות חומצות אמינו overproducers, בעוד מפיקי יתר הרצוי יכול להיות מושמד בטעות בשל תופעות לוואי שליליות.
כאן, אסטרטגיה הרומן המבוססת על החוק של קודון הטיה מוצגת על מנת להשיג זהויות מדויקות ומהירה של מפיקים יתר של חומצות אמינו. חומצות אמינו רוב מקודדים על ידי יותר מאשר שלישיה נוקלאוטיד אחד כי הוא המועדף באופן שונה על ידי אורגניזמים המארחים8,9. מספר משתמשים מסוימים משמשים לעתים רחוקות ברצפי הקידוד ומכונים הקודונים נדירים. התרגומים שלהם לתוך חומצות אמינו מסתמכים על trnas קנצוני לשאת את חומצות האמינו המתאימות. עם זאת, tRNAs המכירים בקודונים נדירים יש בדרך כלל הרבה יותר מחולות מאשר tRNAs של הקודונים המשותפים10,11. כתוצאה מכך, tRNAs נדירים אלה פחות סביר ללכוד את חומצות האמינו חינם בתחרויות עם איזוזמינים אחרים, ותרגומים של הרצפים נדיר-codon-עשיר מתחילים להאט או אפילו מסתיימים כאשר כמויות של חומצות אמינו מוגבלות 10. התרגומים יכולים, תיאורטית, להיות משוחזר אם יש עודף חומצת אמינו לאחר הטענת tRNAs משותף נרדף בשל הפקות יתר או ההאכלה נוספת של חומצות אמינו המקביל12. אם הגנטי נדיר-codon-עשיר מקודד בחירה או סמן ההקרנה, זנים המציגות פנוטיפים המתאימים יכול להיות מזוהה בקלות וכנראה המפיקים יתר של חומצות אמינו ממוקדות.
האסטרטגיה הנ ל מיושמת על מנת ליצור מבחר ומערכת הקרנה לזיהוי מפיקי יתר של חומצות אמינו. מערכת הבחירה משתמשת גנים עמידות לאנטיביוטיקה (g., KanR) כמו סמנים בעוד מערכת ההקרנה משתמשת הגנים הקידוד פלורסנט (למשל, חלבון פלורסנט ירוק [gfp]) או כרומוגניים (למשל, פראנצרסגול) חלבונים. הגנים סמן בשתי המערכות משתנים על ידי החלפת מספרים מוגדרים של הקודונים המשותפים עבור חומצת האמינו הממוקדת עם חלופה נדירה נרדפת. זנים בספריית מוטציה כי הנמל הגן נדיר-codon-עשיר סמן בחרו או הוקרן בתנאים הנכונים, ואת מפיקי היתר של חומצות אמינו ממוקדות ניתן לזהות בקלות. זרימת העבודה מתחילה עם בניית מערכת גנטית נדיר codon-עשיר סמן, ואחריו אופטימיזציה של תנאי עבודה, ולאחר מכן זיהוי ואימות של חומצות אמינו מפיקים יתר. זו אסטרטגיה בלתי תלויה אנלוגי מבוסס על הדוגמה בתרגום חלבונים ומאומת למעשה כדי לאפשר זהויות מדויקות ומהירה של מפיקי חומצות אמינו. תיאורטית, זה יכול להיות מועסק ישירות עם חומצות אמינו עם מיקרודונים נדירים ועל כל המיקרואורגניזמים. בסך הכל, האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס ישמש חלופה יעילה לגישה המקובלת מבוססי אנלוגי כאשר אנלוגי הנכון עבור חומצות אמינו ספציפיות אינן זמינות, או כאשר שיעור חיובי שווא גבוה הוא הדאגה העיקרית. הפרוטוקול שלהלן משתמש לאוצין נדיר קודון להפגין את האסטרטגיה הזאת בזיהוי es, coli קולי L-לאוצין מפיקי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר המקורות הנדירים בגנים הסמן והבחירה או הסינון הם קריטיים לעכב את ביטויי החלבון מהגנים הנדירים של הסמן השונה-codons. אם לא ניתן לזהות הבדל משמעותי בין ביטויי חלבון מן הגנים סמן פראי ונגזרות שלהם, הגדלת מספר החומרים הנדירים או שימוש במדיום מוגבלת מזינים עשוי להגביר את ההבדלים. עם זאת, אם אפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה היתה נתמכת במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט no. 21676026), המפתח הלאומי R & D תוכנית של סין (להעניק no. 2017YFD0201400), ואת הקרן פוסט דוקטורט בסין (להעניק no. 2017M620643). עבודות במכון לקידום באוניברסיטת UCLA (סאזהאו) תמכו על ידי מענקים פנימיים מפרובינצית ג’יאנגסו ופארק התעשייה סאזהאו.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
- Tatsumi, N., Inui, M. . Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. . DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
- Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
- Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
- Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
- Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
- Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
- Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
- Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
- Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
- Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
- Xiong, A. -. S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
- Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
- Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
- Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
- Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
- Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
- Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
- Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
- Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
- Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
- Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
- Huo, Y. -. X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).
