Identifizieren von Aminosäure-Overproduzenten mit selten-Codon-reichen Markern

Die aktuelle Produktion von Aminosäuren hängt stark von der Fermentation ab. Allerdings liegen die Titer und Erträge für die meisten Aminosäurenproduktionsstämme unter den steigenden Anforderungen des globalen Aminosäuremarktes, der Milliarden von Dollar wert ist^1,2. Die Gewinnung von Hochleistungs-Aminosäure-Overproduzenten sind entscheidend für die Aufwertung der Aminosäureindustrie.

Traditionelle Strategie zur Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten nutzt die Wettbewerbe zwischen Aminosäuren und ihren Analoga in der Proteinsynthese^3,4. Diese Analoga sind in der Lage, die tRNAs aufzuladen, die die entsprechenden Aminosäuren erkennen und so die Dehnungen der Peptidketten hemmen, was zu festem Wachstum oder Zelltod^{führt 5}. Eine Möglichkeit, den analogen Spannungen zu widerstehen, besteht darin, die Konzentrationen von intrazellulären Aminosäuren zu erhöhen. Die angereicherten Aminosäuren übertreffen die Analoga für die endlichen tRNAs und sorgen für die korrekte Synthese funktioneller Proteine. Daher können Stämme, die die Analoga überleben, ausgewählt werden und sind wahrscheinlich die Überproduzenten der entsprechenden Aminosäuren.

Obwohl sich bei der Auswahl von Überproduzenten für Aminosäuren wie L-Leucin⁶als erfolgreich erwiesen hat, leidet die analoge Strategie unter gravierenden Nachteilen. Ein Hauptanliegen ist der analoge Widerstand, der aus dem Prozess der Mutagenese oder durch spontane Mutationen entstanden ist. Stämme mit Widerstand können der Auswahl entkommen, indem sie die Analoga⁵blockieren, exportieren oder herabstufen. Ein weiteres Problem sind die toxischen Nebenwirkungen der Analoga auf andere zelluläre Prozesse⁷. Infolgedessen können Stämme, die die analoge Selektion überleben, nicht die Aminosäure-Overproduzenten sein, während die gewünschten Overproduzenten aufgrund der negativen Nebenwirkungen fälschlicherweise ausgerottet werden könnten.

Hier wird eine neuartige Strategie vorgestellt, die auf dem Gesetz der Kodonvoreingenommenheit basiert, um genaue und schnelle Identifizierungen von Aminosäureüberproduzenten zu erreichen. Die meisten Aminosäuren werden durch mehr als ein Nukleotid-Triplet kodiert, das von den Wirtsorganismen anders bevorzugt wird^8,9. Einige Codons werden selten in den Codierungssequenzen verwendet und werden als die seltenen Codons bezeichnet. Ihre Übersetzungen in Aminosäuren basieren auf den cognate tRNAs, die die entsprechenden Aminosäuren tragen. Jedoch, die tRNAs, die seltene Codons erkennen, haben in der Regel viel geringere Überfluss als die tRNAs der gemeinsamen Codons^10,11. Folglich sind diese seltenen tRNAs weniger wahrscheinlich, die freien Aminosäuren in den Wettbewerben mit anderen Isoaktoren zu erfassen, und Übersetzungen der selten-codonreichen Sequenzen beginnen zu verlangsamen oder werden sogar beendet, wenn die Mengen an Aminosäuren begrenzt ^{sind. 10}. Die Übersetzungen könnten theoretisch wiederhergestellt werden, wenn nach dem Aufladen der synonymen gemeinsamen tRNAs aufgrund von Überproduktionen oder Extra-Fütterungen der entsprechenden Aminosäuren¹²ein Aminosäureüberschuss vorliegt. Wenn das selten-kodonreiche Gen einen Selektions- oder Screening-Marker kodiert, können Stämme, die die entsprechenden Phänotypen aufweisen, leicht identifiziert werden und sind wahrscheinlich die Überproduzenten der zielgerichteten Aminosäuren.

Die obige Strategie wird angewendet, um eine Auswahl und ein Screening-System zur Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten zu etablieren. Das Selektionssystem verwendet Antibiotikaresistenzgene (z. B. kan^R) als Marker, während das Screening-System die Gene verwendet, die fluoreszierende (z. B. grünes fluoreszierendes Protein [GFP]) oder chromogene (z. B. PrancerPurple) Proteine kodieren. Die Markergene in beiden Systemen werden modifiziert, indem definierte Zahlen der gemeinsamen Codons für die zielgerichtete Aminosäure durch ihre synonyme seltene Alternative ersetzt werden. Stämme in der Mutationsbibliothek, die das selten-kodonreiche Markergen beherbergen, werden unter geeigneten Bedingungen ausgewählt oder gescreent, und die Überproduzenten der zielgerichteten Aminosäuren können leicht identifiziert werden. Der Arbeitsablauf beginnt mit dem Aufbau des selten-kodonreichen Marker-Gensystems, gefolgt von der Optimierung der Arbeitsbedingungen und der Identifizierung und Verifizierung der Aminosäure-Überproduzenten. Diese analog-unabhängige Strategie basiert auf dem Dogma in der Proteintranslation und wurde praktisch verifiziert, um eine genaue und schnelle Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten zu ermöglichen. Theoretisch könnte es direkt an Aminosäuren mit seltenen Codons und an alle Mikroorganismen angewendet werden. Insgesamt wird die auf seltenen Kodonen basierende Strategie als effiziente Alternative zum herkömmlichen analogen Ansatz dienen, wenn geeignete Analoga für bestimmte Aminosäuren nicht verfügbar sind oder wenn eine hohe falsch positive Rate das Hauptanliegen ist. Das nachstehende Protokoll verwendet seltenes Leucin-Kodon, um diese Strategie bei der Identifizierung von Escherichia coli L-Leucin-Overproduzenten zu demonstrieren.