希少コドンリッチマーカーを用いてアミノ酸過剰生産者を同定

アミノ酸の現在の生産は、発酵に大きく依存しています。しかし、ほとんどのアミノ酸産生株の力価および収量は、数十億ドルの価値がある世界的なアミノ酸市場の需要の高まりを下回っています^1,2.アミノ酸産業のアップグレードには、高性能アミノ酸過剰生産者の獲得が重要です。

アミノ酸過剰生産者を同定する従来の戦略は、タンパク質合成^におけるアミノ酸とその類似体との競争を利用する3,⁴.これらの類似体は、対応するアミノ酸を認識するtRNAを充電し、したがってペプチド鎖の伸びを阻害し、逮捕された増殖または細胞死5につながる。アナログストレスに抵抗する 1 つの方法は、細胞内アミノ酸の濃度を増加させます。.濃縮アミノ酸は、有限tRNAのアナログを上回り、機能性タンパク質の正しい合成を保証します。したがって、類似体を生き残る株は選択することができ、対応するアミノ酸の過剰生産者である可能性が高い。

L-ロイシン6などのアミノ酸の過剰生産者の選択に成功したが、アナログベースの戦略は深刻な欠点に苦しんでいる。主な懸念の1つは、変異形成の過程または自発的な突然変異によって生じたアナログ抵抗である。抵抗を持つ株は、アナログ5を遮断、エクスポート、または劣化することによって選択を逃^{れることができます。}もう一つの懸念は、他の細胞プロセス7にアナログの有毒な副作用です。その結果、アナログ選択を生き残る株はアミノ酸過剰生産者ではないかもしれませんが、所望の過剰生産者は負の副作用のために誤って根絶される可能性があります。

ここでは、アミノ酸過剰生産者の正確かつ迅速な同定を達成するために、コドンバイアスの法則に基づく新しい戦略を提示する。ほとんどのアミノ酸は、宿主生物8、9によって異なって好まれる複数のヌクレオチドトリプレットによってコードされる。一部のコドンはコーディングシーケンスではほとんど使用されず、希少なコドンと呼ばれています。アミノ酸への彼らの翻訳は、対応するアミノ酸を運ぶ認知tRNAに依存しています.しかし、希少なコドンを認識するtRNAは、通常、一般的なコドン10、11のtRNAよりもはるかに低い存在量を持っています。その結果、これらの希少なtRNAは、他のアイソセプターとの競争で遊びのアミノ酸を捕捉する可能性が低く、希少コドンリッチ配列の翻訳は、アミノ酸の量が限られている^{ときに減速し始めるか、あるいは終了する10.}翻訳は、理論的には、対応するアミノ^酸12の過剰産生または余分な供給に起因する同義の一般的なtRNAを充電した後にアミノ酸の余剰がある場合に復元することができる。希少コドンリッチ遺伝子が選択マーカーまたはスクリーニングマーカーをコードする場合、対応するフェノタイプを示す株を容易に同定することができ、標的アミノ酸の過剰生産者である可能性が高い。

上記の戦略は、アミノ酸過剰生産者の同定のための選択およびスクリーニングシステムを確立するために適用される。選択システムは、抗生物質耐性遺伝子(例えば、カンR)をマーカーとして使用し、スクリーニングシステムは蛍光をコードする遺伝子(例えば、緑色蛍光タンパク質[GFP])または発色性(例えば、PrancerPurple)タンパク質を使用する。両方のシステムのマーカー遺伝子は、標的アミノ酸の共通コドンの定義された数をその代名詞希少代替に置き換えることによって修飾される。希少コドンリッチマーカー遺伝子を保有する変異ライブラリー内の株は、適切な条件下で選択またはスクリーニングされ、標的アミノ酸の過剰生産者を容易に同定することができる。ワークフローは、希少コドンリッチマーカー遺伝子システムの構築から始まり、その後、労働条件の最適化、次にアミノ酸オーバープロデューサーの同定と検証が行われます。このアナログ非依存戦略は、タンパク質翻訳の教義に基づいており、アミノ酸オーバープロデューサーの正確かつ迅速な同定を可能にするために実質的に検証されています。理論的には、希少なコドンを含むアミノ酸やすべての微生物に直接使用することができます。全体として、希少コドンベースの戦略は、特定のアミノ酸に対する適切なアナログが利用できない場合、または高い偽陽性率が主な懸念事項である場合に、従来のアナログベースのアプローチに代わる効率的な代替手段として機能します。以下のプロトコルは、ロイシンレアコドンを使用して、エシェリヒア大腸菌L-ロイシンオーバープロデューサーを同定する際にこの戦略を実証します。