Identificare gli amminoacidi sovraproduttori utilizzando marcatori rari-codoni-ricchi
Summary
Questo studio presenta una strategia alternativa al metodo tradizionale basato sull’analogico tossico nell’identificazione di sovraproduttori di amminoacidi utilizzando marcatori rari ricchi di codoni per ottenere contemporaneamente precisione, sensibilità e alta produttività.
Abstract
Per soddisfare il mercato in continua crescita per gli amminoacidi, sono necessari ceppi di produzione ad alte prestazioni. I prodotti non amnopesonoari sono convenzionalmente identificati sfruttando i concorsi tra gli amminoacidi e i loro analoghi. Tuttavia, questo metodo basato su analogico è di bassa precisione e gli analoghi appropriati per gli amminoacidi specifici sono limitati. Qui, presentiamo una strategia alternativa che consente uno screening accurato, sensibile e ad alta velocità di produzione di amminoacidi utilizzando marcatori rari ricchi di codoni. Questa strategia è ispirata al fenomeno della distorsione dell’uso del codone nella traduzione delle proteine, per la quale i codoni sono classificati in comuni o rari in base alle loro frequenze di occorrenza nel DNA codificante. La traduzione di codoni rari dipende dai corrispondenti RNA di trasferimento rari (tRNA), che non possono essere completamente addebitati dagli amminoacidi cognati in condizioni di fame. Teoricamente, i tRNA rari possono essere addebitati se c’è un surplus di aminoacidi dopo aver caricato i sinonimi isoacceptors comuni. Pertanto, le traduzioni ritardate causate da codoni rari potrebbero essere ripristinate alimentando o sovrapproduzione intracellulari degli amminoacidi corrispondenti. In base a questa ipotesi, viene istituito un sistema di selezione o screening per l’identificazione dei sovraproduttori di amminoacidi sostituendo i codoni comuni degli amminoacidi mirati con le loro alternative rare sinonimi nei geni di resistenza agli antibiotici o nei geni codificare proteine fluorescenti o cromogene. Dimostriamo che le espressioni proteiche possono essere notevolmente ostacolate dall’incorporazione di codoni rari e che i livelli di proteine sono correlati positivamente con le concentrazioni di amminoacidi. Utilizzando questo sistema, gli sovraproduttori di aminoacidi multipli possono essere facilmente esaminati dalle librerie di mutazioni. Questa strategia basata su codone rara richiede solo un singolo gene modificato, e l’ospite è meno probabile che sfuggirà alla selezione rispetto ad altri metodi. Offre un approccio alternativo per ottenere i non amminoacidi sovraproduttori.
Introduction
L’attuale produzione di amminoacidi dipende fortemente dalla fermentazione. Tuttavia, i titoli e le rese per la maggior parte dei ceppi di produzione di amminoacidi sono al di sotto delle crescenti richieste del mercato globale degli amminoacidi che vale miliardi di dollari1,2. Ottenere prodotti aminoacidi ad alte prestazioni sono fondamentali per l’aggiornamento dell’industria degli amminoacidi.
La strategia tradizionale per identificare i sovraproduttori di amminoacidi sfrutta i concorsi tra aminoacidi e i loro analoghi nella sintesi proteica3,4. Questi analoghi sono in grado di caricare i tRNA che riconoscono gli aminoacidi corrispondenti e quindi inibiscono gli allungamenti delle catene di peptidi, portando alla crescita arrestata o alla morte cellulare5. Un modo per resistere alle sollecitazioni analogiche è quello di aumentare le concentrazioni di aminoacidi intracellulari. Gli amminoacidi arricchiti supereranno gli analoghi per i tRNA finiti e garantiranno la corretta sintesi delle proteine funzionali. Pertanto, i ceppi che sopravvivono agli analoghi possono essere selezionati e sono probabilmente i sovraproduttori degli amminoacidi corrispondenti.
Sebbene si sia dimostrata efficace nella selezione di sovraproduttori di amminoacidi come L-leucina6, la strategia analogica soffre di gravi inconvenienti. Una delle principali preoccupazioni è la resistenza analogica originatadal processo di mutagenesi o attraverso mutazioni spontanee. I ceppi di resistenza possono sfuggire alla selezione bloccando, esportando o degradando gli analoghi5. Un’altra preoccupazione sono gli effetti collaterali tossici degli analoghi su altri processi cellulari7. Di conseguenza, i ceppi che sopravvivono alla selezione analogica potrebbero non essere i sovraproduttori di amminoacidi, mentre gli overproduttori desiderati potrebbero essere falsamente sterminati a causa degli effetti collaterali negativi.
Qui viene presentata una nuova strategia basata sulla legge del pregiudizio del codone al fine di ottenere identificazioni accurate e rapide dei sovraproduttori di amminoacidi. La maggior parte degli amminoacidi sono codificati da più di una tripletta nucleotide che è favorita in modo diverso dagli organismi ospiti8,9. Alcuni codoni sono raramente utilizzati nelle sequenze di codifica e sono indicati come i codoni rari. Le loro traduzioni in amminoacidi si basano sui tRNA cognati che trasportano gli aminoacidi corrispondenti. Tuttavia, i tRNA che riconoscono codoni rari di solito hanno abbondanza molto più basse rispetto ai tRNA dei codoni comuni10,11. Di conseguenza, questi rari tRNA hanno meno probabilità di catturare gli amminoacidi liberi nei concorsi con altri isoaccettatori, e le traduzioni delle sequenze rare ricche di codoni iniziano a rallentare o addirittura vengono terminate quando le quantità di aminoacidi sono limitate 10. Le traduzioni potrebbero, teoricamente, essere ripristinate se c’è un surplus di amminoacidi dopo aver caricato i sinonimi tRNA comuni a causa di sovraproduzioni o alimentamenti supplementari degli amminoacidi corrispondenti12. Se il gene raro ricco di codone codifica un marcatore di selezione o di screening, i ceppi che esibiscono i fenotipi corrispondenti possono essere facilmente identificati e sono probabilmente i sovraproduttori degli amminoacidi mirati.
La strategia di cui sopra viene applicata per stabilire una selezione e un sistema di screening per l’identificazione dei sovraproduttori di amminoacidi. Il sistema di selezione utilizza come marcatori i geni di resistenza agli antibiotici (ad esempio, kanR),mentre il sistema di screening utilizza le proteine fluorescenti di codifica dei geni (ad esempio, proteine fluorescenti verdi [GFP]) o cromogeniche (ad esempio, PrancerPurple). I geni marcatori in entrambi i sistemi vengono modificati sostituendo il numero definito dei codoni comuni per l’amminoacido mirato con la sua rara alternativa sinonimo. I ceppi nella libreria di mutazioni che ospitano il gene marcatore raro-codon-ricco sono selezionati o sottoposti a screening in condizioni adeguate, e gli overproduttori degli amminoacidi mirati possono essere facilmente identificati. Il flusso di lavoro inizia con la costruzione del sistema genetico marcatore raro-codon-ricco, seguita dall’ottimizzazione delle condizioni di lavoro, e quindi con l’identificazione e la verifica degli amminoacidi sovraproduttori. Questa strategia analogico-indipendente si basa sul dogma nella traduzione delle proteine ed è stata praticamente verificata per consentire identificazioni accurate e rapide dei sovraproduttori di amminoacidi. Teoricamente, potrebbe essere impiegato direttamente agli amminoacidi con codoni rari e a tutti i microrganismi. In tutto, la strategia basata su codone raro servirà come un’alternativa efficiente all’approccio analogico convenzionale quando non sono disponibili analoghi appropriati per specifici amminoacidi, o quando un alto tasso di falsi positivi è la preoccupazione principale. Il protocollo seguente utilizza codone raro leucina per dimostrare questa strategia nell’identificazione di Escherichia coli L-leucine iperproduttori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il numero di codoni rari nei geni marcatori e nel mezzo di selezione o screening è fondamentale per inibire le espressioni proteiche dai geni marcatori raramente-modificato codoni. Se non è possibile rilevare alcuna differenza significativa tra le espressioni proteiche dei geni marcatori di tipo selvatico e i loro derivati, l’aumento del numero di codoni rari o l’utilizzo di un mezzo limitato dai nutrienti può amplificare le differenze. Tuttavia, se l’effetto di inibizione è troppo forte, le espressioni proteiche non…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto congiuntamente dalla National Natural Science Foundation of China (n. 21676026), dal National Key R&D Program of China (grant n. 2017YFD0201400) e dalla China Postdoctoral Science Foundation (n. 2017M620643). I lavori dell’UCLA Institute of Advancement (Suzhou) sono stati sostenuti dalle sovvenzioni interne della provincia di Jiangsu e del Parco Industriale di Suzhou.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
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