Nadir-Codon zengin Işaretçileri kullanarak amino asit Overüreticiler tanımlama
Summary
Bu çalışmada, aynı anda doğruluk, hassasiyet ve yüksek verim elde etmek için nadir kodon zengin işaretçileri kullanarak amino asit overüreticilerinin belirlenmesi geleneksel toksik analog tabanlı yöntem için alternatif bir strateji sunar.
Abstract
Amino asitler için sürekli büyüyen pazar karşılamak için, yüksek performanslı üretim suşları gereklidir. Amino asit overüreticiler geleneksel olarak amino asitler ve onların analogları arasındaki yarışmalar harnessing tarafından tanımlanır. Ancak, bu analog tabanlı yöntem düşük doğruluk ve spesifik amino asitler için uygun analoglar sınırlıdır. Burada, nadir-Codon zengin işaretçileri kullanan amino asit overüreticilerinin doğru, hassas ve yüksek verim taramasına olanak tanıyan alternatif bir strateji sunuyoruz. Bu strateji, protein çevirisi içinde kodon kullanım önyargı fenomen esinlenerek, hangi kodon ortak veya nadir olanlar kodlama DNA oluşumu onların frekansları dayalı kategorilere ayrılır. Nadir bulunan kodların çevirisi, ilgili nadir transfer RNAs ‘larına (tRNAs) bağlıdır ve bu da açlık altında bilat amino asitleri tarafından tam olarak şarj edilemez. Teorik olarak, aynı derecede ortak isoacceptors şarj ettikten sonra amino asitler fazlasının varsa nadir tRNAs şarj edilebilir. Bu nedenle, seyrek kodların neden olduğu geri zekalı Çeviriler, karşılık gelen amino asitlerin beslenme veya hücre içi aşırı üretimleri ile restore edilebilir. Bu varsayımı altında, amino asit overüreticileri tanımlamak için bir seçim veya tarama sistemi hedeflenen amino asitlerin ortak kodon antibiyotik direnci genler veya genler kendi eşanlamlı nadir alternatifleri ile değiştirerek kurulur Floresan veya kromojenik proteinleri kodlama. Biz protein ifadeleri büyük ölçüde nadir kodon birleşmesi ile engellenebilir ve proteinlerin düzeyleri amino asit konsantrasyonları ile olumlu ilişkilendirir gösterir. Bu sistemi kullanarak, birden fazla amino asitlerin overüreticiler kolayca mutasyon kütüphaneleri dışarı ekranlaştırılmış olabilir. Bu nadir kodon tabanlı strateji sadece tek bir değiştirilmiş gen gerektirir ve ev sahibi diğer yöntemlerden daha seçim kaçmak için daha az muhtemeldir. Amino asit overüreticileri elde etmek için alternatif bir yaklaşım sunar.
Introduction
Amino asitler mevcut üretim fermantasyon üzerinde ağır dayanır. Ancak, çoğu amino asit üretim suşları için yazılar ve verimler milyarlarca dolar değerinde küresel amino asit piyasasının yükselen taleplerinin altındadır1,2. Yüksek performanslı amino asit aşırı üreticileri elde etmek için amino asit endüstrisinin yükseltilmesi önemlidir.
Amino asit aşırı üreticileri tanımlamak için geleneksel strateji amino asitler ve protein sentezinde onların analogları arasındaki yarışmalar yararlanırlar3,4. Bu analoglar karşılık gelen amino asitler tanımak ve böylece peptid zincirleri uzaması inhibe tRNAs şarj edebiliyoruz, tutuklandı büyüme veya hücre ölümü5yol. Analog streslere karşı bir yol, hücre içi amino asitlerin konsantrasyonlarını artırmaktır. Zenginleştirilmiş amino asitler sonlu tRNAs için analogları aşacak ve fonksiyonel proteinlerin doğru sentezini sağlamaktır. Bu nedenle, analoglar hayatta suşları seçilebilir ve ilgili amino asitlerin overüreticiler muhtemeldir.
L-leucine6gibi amino asitler için overüreticiler seçiminde başarılı olmasına rağmen, analog tabanlı strateji ciddi dezavantajları muzdarip. Bir büyük endişe analog direnç mutagenez işleminden kaynaklanan veya spontan mutasyonlar yoluyla. Direnç ile suşları engelleme, ihracat veya analoglar5aşağılayıcı tarafından seçim kaçabilir. Başka bir endişe diğer hücresel süreçlerde analogların toksik yan etkileri7. Sonuç olarak, analog seçimden hayatta kalan suşlar amino asit overüreticileri olmayabilir, istenilen overüreticileri olumsuz yan etkileri nedeniyle yanlışlıkla imha olabilir iken.
Burada, kodon önyargı yasasına dayalı bir yeni strateji amino asit overüreticilerinin doğru ve hızlı kimliklere ulaşmak için sunulmuştur. Çoğu amino asitler, ev sahibi organizmaların8,9tarafından farklı bir şekilde tercih edilen birden fazla nükl üçlüsü tarafından kodlanmıştır. Bazı kodlar, kodlama dizilerinde nadiren kullanılır ve nadir kodlar olarak adlandırılır. Amino asitler içine çevirileri ilgili amino asitler taşıyan bilat tRNAs güveniyor. Ancak, nadir codonlar tanıyan trnas genellikle10,11ortak kodon trnas daha fazla düşük fazlalıkları vardır. Sonuç olarak, bu nadir tRNAs diğer isoacceptors ile yarışmalarda ücretsiz amino asitler yakalamak için daha az muhtemeldir, ve nadir-Codon zengin dizileri çevirileri yavaşlama başlar veya amino asitler miktarları sınırlı olduğunda bile sonlandırıldı 10. Çeviriler, teorik olarak, aşırı üretimler veya karşılık gelen amino asitlerin ekstra beslemeleri nedeniyle eş anlamlı ortak tRNAs şarj ettikten sonra bir amino asit fazlaları geri yüklenebilir12. Nadir kodon zengin gen bir seçim veya tarama işaretçisi kodlarsa, karşılık gelen fenotürler sergileme suşları daha sonra kolayca tespit edilebilir ve muhtemelen hedeflenen amino asitlerin overüreticiler.
Yukarıdaki strateji, amino asit overüreticilerinin tanımlanması için bir seçim ve bir tarama sistemi kurmak için uygulanır. Seçim sistemi antibiyotik direnci genleri kullanır (örn., kanR) işaretleme sistemi, floresan (örneğin, yeşil floresan protein [Gfp]) veya kromojenik (örneğin, prancerpurple) proteinleri kodlama genler kullanır iken işaretçileri olarak. Her iki sistemde de Marker genler eş anlamlı nadir alternatif ile hedeflenen amino asit için ortak kodon tanımlanmış sayılar değiştirerek değiştirilir. Nadide-Codon zengin Marker geni limandaki mutasyon kütüphanesinde bulunan suşlar, uygun koşullar altında seçilir veya ekranlanır ve hedeflenen amino asitlerin overüreticileri kolayca tespit edilebilir. İş akışı ender-Codon zengin Marker gen sisteminin inşası ile başlar, çalışma koşullarının optimizasyonu ve ardından amino asit overüreticilerinin tanımlanması ve doğrulanması. Bu analog-bağımsız strateji protein çevirisi dogma dayanır ve pratikte amino asit overüreticisinin doğru ve hızlı tanımlamalarını sağlamak için doğrulanmıştır. Teorik olarak, nadir codonlar ve tüm mikroorganizmalar ile amino asitlere doğrudan istihdam edilebilir. Tüm, nadir-Codon tabanlı strateji, belirli amino asitler için uygun analogları kullanılamıyor, ya da yüksek bir yanlış pozitif oran büyük endişe olduğunda geleneksel analog tabanlı yaklaşımı için etkili bir alternatif olarak hizmet verecektir. Aşağıdaki protokol, Escherichia coli L-lösin overüreticileri tanımlamada bu stratejiyi göstermek için lösin nadir kodon kullanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Marker genler ve seçim veya tarama Orta nadir kodon sayısı nadir-Codon-modifiye Marker genler protein ifadeleri inhibe etmek için önemlidir. Vahşi tip Marker genler ve türevlerinden protein ifadeleri arasında önemli bir fark tespit edilemez, nadir codonlar sayısını artırarak veya bir besin sınırlı orta kullanarak farklılıkları güçlendirebilir. Ancak, inhibisyon etkisi çok güçlü ise, protein ifadeleri bile karşılık gelen amino asitlerin ekstra beslenme tarafından kurtarılabilir olmayabilir. B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
İş ortaklaşa Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 21676026), ulusal anahtar R & D programı Çin (Grant No. 2017YFD0201400) ve Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (Grant No. 2017M620643) tarafından desteklenmektedir. UCLA Gelişim Enstitüsü ‘nde (Suzhou) çalışan Jiangsu Eyaleti ve Suzhou Industrial Park iç hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
- Tatsumi, N., Inui, M. . Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. . DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
- Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
- Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
- Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
- Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
- Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
- Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
- Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
- Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
- Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
- Xiong, A. -. S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
- Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
- Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
- Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
- Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
- Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
- Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
- Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
- Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
- Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
- Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
- Huo, Y. -. X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).
