تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة Codon الغنية
Summary
تقدم هذه الدراسة استراتيجية بديلة للطريقة التقليدية السامة المستندة إلى التناظرية في تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة الغنية codon لتحقيق الدقة والحساسية، والإنتاجية العالية في وقت واحد.
Abstract
لتلبية السوق المتنامية باستمرار للأحماض الأمينية، هناك حاجة إلى سلالات الإنتاج عالية الأداء. يتم تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية بشكل تقليدي عن طريق تسخير المسابقات بين الأحماض الأمينية ونظائرها. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة المستندة إلى التناظرية هي من دقة منخفضة، ونظائرها المناسبة للأحماض الأمينية محددة محدودة. هنا، نقدم استراتيجية بديلة تمكن من فحص دقيق وحساس وعالي الإنتاجية للإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة غنية بالكودون. هذه الاستراتيجية مستوحاة من ظاهرة التحيز استخدام codon في ترجمة البروتين، والتي يتم تصنيف codons في تلك الشائعة أو النادرة على أساس ترددات حدوثها في الحمض النووي الترميز. تعتمد ترجمة codons النادرة على نقلها النادر المقابل RNAs (tRNAs)، والتي لا يمكن شحنها بالكامل من قبل الأحماض الأمينية الكونات تحت المجاعة. من الناحية النظرية، يمكن شحن tRNAs نادرة إذا كان هناك فائض من الأحماض الأمينية بعد شحن isoacceptors المشتركة مرادفة. ولذلك، يمكن استعادة الترجمات المتخلفة الناجمة عن codons نادرة عن طريق التغذية أو الإفراط داخل الخلايا من الأحماض الأمينية المقابلة. في ظل هذا الافتراض، يتم إنشاء نظام اختيار أو فحص لتحديد الإفراط في الأحماض الأمينية عن طريق استبدال codons المشتركة من الأحماض الأمينية المستهدفة مع بدائلها النادرة مرادفة في جينات مقاومة المضادات الحيوية أو الجينات ترميز البروتينات الفلورية أو الكروموجينية. نبين أن تعبيرات البروتين يمكن أن تعوق إلى حد كبير من خلال إدراج codons نادرة وأن مستويات البروتينات ترتبط بشكل إيجابي مع تركيزات الأحماض الأمينية. باستخدام هذا النظام، يمكن فحص الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المتعددة بسهولة من مكتبات الطفرات. تتطلب هذه الاستراتيجية المستندة إلى codon النادرة جينًا معدلًا واحدًا فقط، والمضيف أقل احتمالاً للهروب من الاختيار منه في طرق أخرى. ويوفر نهجا بديلا للحصول على الإفراط في الأحماض الأمينية.
Introduction
يعتمد الإنتاج الحالي للأحماض الأمينية بشكل كبير على التخمير. ومع ذلك، فإن titers والغلة لمعظم سلالات إنتاج الأحماض الأمينية هي أقل من الطلب المتزايد لسوق الأحماض الأمينية العالمية التي تبلغ قيمتها مليارات الدولارات1،2. الحصول على الإفراط في الأحماض الأمينية عالية الأداء أمر بالغ الأهمية لرفع مستوى صناعة الأحماض الأمينية.
الاستراتيجية التقليدية لتحديد الأحماض الأمينية الإفراط في الشركات يستغل المسابقات بين الأحماض الأمينية ونظائرها في تخليق البروتين3،4. هذه النظيرات قادرة على شحن tRNAs التي تعترف الأحماض الأمينية المقابلة وبالتالي تمنع استطالة سلاسل الببتيد، مما يؤدي إلى النمو القبض أو موت الخلية5. إحدى الطرق لمقاومة الضغوط التناظرية هي زيادة تركيزات الأحماض الأمينية داخل الخلايا. الأحماض الأمينية المخصب سوف تتفوق على النظير لtRNAs محدودة وضمان التوليف الصحيح للبروتينات الوظيفية. ولذلك، يمكن اختيار السلالات التي البقاء على قيد الحياة النظير ومن المرجح أن الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المقابلة.
على الرغم من أن ثبت نجاحها في اختيار الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية مثل L-ليوسين6, الاستراتيجية التناظرية القائمة على يعاني من عيوب شديدة. أحد الشواغل الرئيسية هو المقاومة التناظرية التي نشأت من عملية الطفرات أو من خلال الطفرات العفوية. سلالات مع المقاومة يمكن الهروب من الاختيار عن طريقحظر أو تصدير أو تدهور النظير 5. قلق آخر هو الآثار الجانبية السامة للنظائر على العمليات الخلوية الأخرى7. ونتيجة لذلك, السلالات التي البقاء على قيد الحياة اختيار التناظرية قد لا يكون الإفراط في الأحماض الأمينية, في حين أن الإفراط المطلوب يمكن إبادة زورا بسبب الآثار الجانبية السلبية.
هنا، يتم تقديم استراتيجية جديدة على أساس قانون التحيز codon من أجل تحقيق تحديد دقيق وسريع للإفراط في الأحماض الأمينية. يتم ترميز معظم الأحماض الأمينية من قبل أكثر من ثلاثي النيوكليوتيد الذي يفضل بشكل مختلف من قبل الكائنات الحية المضيفة8،9. ونادرا ً ما يتم استخدام بعض codons في تسلسلات الترميز ويشار إليها باسم codons النادرة. ترجماتها إلى الأحماض الأمينية تعتمد على tRNAs الكونات التي تحمل الأحماض الأمينية المقابلة. ومع ذلك، فإن tRNAs التي تعترف codons نادرة عادة ما يكون وفرة أقل بكثير من tRNAs من codons المشتركة10،11. وبالتالي، فإن هذه الـ tRNAs النادرة أقل احتمالاً لالتقاط الأحماض الأمينية الحرة في المسابقات مع النظائر الأخرى، وتبدأ ترجمات التسلسلات الغنية بالكدون النادرة في التباطؤ أو حتى يتم إنهاؤها عندما تكون كميات الأحماض الأمينية محدودة 10.يمكن استعادة الترجمات، من الناحية النظرية، إذا كان هناك فائض من الأحماض الأمينية بعد شحن tRNAs المشتركة مرادفة بسبب الإفراط في الإنتاج أو التغذية الإضافية من الأحماض الأمينية المقابلة12. إذا كان الجين النادر الغنية codon ترميز مجموعة أو علامة الفرز، يمكن بعد ذلك تحديد سلالات تظهر الأنماط الظاهرية المقابلة ومن المرجح أن تكون الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المستهدفة.
يتم تطبيق الاستراتيجية المذكورة أعلاه لإنشاء نظام اختيار وفحص لتحديد الإفراط في الأحماض الأمينية. يستخدم نظام الاختيار جينات مقاومة المضادات الحيوية (على سبيل المثال، kanR)كعلامات بينما يستخدم نظام الفحص الجينات ترميز الفلورسنت (على سبيل المثال، بروتين الفلورسنت الأخضر [GFP]) أو الكروموجينيك (على سبيل المثال، PrancerPurple) البروتينات. يتم تعديل جينات العلامة في كلا النظامين عن طريق استبدال أرقام محددة من codons المشتركة للحمض الأميني المستهدف مع بديل نادر مرادف لها. يتم اختيار السلالات في مكتبة الطفرة التي تأوي جين العلامة الغنية بالكدون النادر ة أو فحصها في ظروف مناسبة، ويمكن التعرف بسهولة على الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المستهدفة. يبدأ سير العمل مع بناء نظام الجينات علامة نادرة الغنية codon، تليها الأمثل لظروف العمل، ومن ثم تحديد والتحقق من الإفراط في الأحماض الأمينية. وتستند هذه الاستراتيجية التناظرية المستقلة على العقيدة في ترجمة البروتين، وقد تم التحقق عمليا لتمكين تحديد دقيقة وسريعة من الإفراط في الأحماض الأمينية. من الناحية النظرية، يمكن استخدامه مباشرة إلى الأحماض الأمينية مع codons نادرة وجميع الكائنات الحية الدقيقة. في الكل، فإن الاستراتيجية القائمة على codon نادرة بمثابة بديل فعال للنهج المستندة إلى التناظرية التقليدية عندما النظير السليم للأحماض الأمينية محددة غير متوفرة، أو عندما يكون معدل إيجابي كاذبة عالية هو الشاغل الرئيسي. يستخدم البروتوكول أدناه اللوكين نادرة codon لإثبات هذه الاستراتيجية في تحديد الإشريكية القولونية L-ليوسين الإفراط.
Protocol
Representative Results
Discussion
عدد codons نادرة في الجينات علامة ووسيط الاختيار أو الفرز حاسمة لمنع تعبيرات البروتين من الجينات علامة نادرة codon المعدلة. إذا لم يكن من المتمكن الكشف عن فرق كبير بين تعبيرات البروتين من جينات علامات من النوع البري ومشتقاتها، فإن زيادة عدد الكودونات النادرة أو استخدام وسيلة محدودة بالمغذيات ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
واشتركت في دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 21676026)، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي الوطني في الصين (المنحة رقم 2017YFD0201400)، والمؤسسة الصينية لعلوم ما بعد الدكتوراه (المنحة رقم 2017M620643). وقد تم دعم الأعمال في معهد النهوض بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (سوتشو) من خلال المنح الداخلية من مقاطعة جيانغسو ومنتزه سوتشو الصناعي.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
- Tatsumi, N., Inui, M. . Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. . DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
- Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
- Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
- Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
- Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
- Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
- Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
- Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
- Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
- Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
- Xiong, A. -. S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
- Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
- Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
- Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
- Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
- Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
- Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
- Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
- Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
- Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
- Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
- Huo, Y. -. X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).
