Ассамблея золота наностержни в хиральная плазмонных Metamolecules с помощью ДНК оригами шаблонов

1. Дизайн ДНК-оригами Определите нужный относительный пространственное расположение AuNRs и подходящую форму ДНК оригами шаблон (рис. 1А). Оценки структурных параметров AuNRs и шаблоны оригами. Найдите приблизительной позиции скобы, которые требуют дальнейшего изменения (рис. 1Б). Скачать и установить18 caDNAno разработать шаблон оригами ДНК. CaDNAno маршрут стренги леску и штапель в зависимости от желаемой формы шаблон и создать последовательность основных нитей, нажав Seq инструмент. Выберите Инструмент Paint и Марк основных нитей, которые требуют дальнейшего изменения (рис. 1C). Нажмите кнопку Экспорт инструмент для экспорта основных последовательностей ДНК (рис. 1C) в CSV-файл. Дизайн двунитевая блокировки, чтобы зафиксировать угол Θ между двумя пучками оригами. В зависимости от относительной ориентации двух пучков оригами конструкции можно адаптировать слева – или левши (LH/RH) хиральная пространственной конфигурации (рис. 1Б). Импортируйте скобы CSV-файл в приложении электронной таблицы. Добавление поля10 последовательность в конце скобы, используемые для сборки AuNR (ручки). Измените основной нити на сайтах разработан блокировки с блокировки последовательностями.Примечание: Сборки в результатах представительных содержат 36, ручки, выступающие на 3′ конца основной нити, 18 на каждой связке ДНК оригами, равномерно распределенных на двух параллельных спиралей каждые 21 nt. Расстояние между первой и последней позиции ручку-168 nt, примерно 57 Нм (см. прилагаемый caDNAno файл). 2. Ассамблея ДНК оригами шаблонов Подготовьте рабочий запас основных нитей (SM), включая пряди с ручки и замки, смешиванием равных количеств концентрация нормированный штапельные олигонуклеотиды (например, 100 мкм).Примечание: Оригами структуры обычно содержат несколько сотен основных нитей. Скобы обычно закупаются у производителей, специализирующихся на химическом синтезе ДНК-олигонуклеотиды в multiwell (например, 96-а) пластины. Для 500 мкл 10 Нм оригами, смешайте 50 мкл трис-ЭДТА (TE, 10 x), 100 мкл MgCl2 (100 мм), 25 мкл рабочего раствора NaCl (100 мм), 175 мкл H2O, 100 мкл см (0,5 мкм), 5 мкл блокировки нитей (5 мкм) и леска 50 мкл (100 Нм). Отжиг в смесь в Термоциклер от 80 ° C до 20 ° C, как описано в таблице 1. 3. ДНК оригами очистки Примечание: Этот раздел описывает протокол для очищения геля агарозы. ДНК оригами шаблоны также могут быть очищены с помощью альтернативных подходов38,39. Для гель 1%, растворить 1 g агарозы в 100 мл трис Борат ЭДТА (КЭ, 0.5 x) путем нагревать смесь в микроволновой печи. 10 мкл 10 000 x ДНК пятно согласно спецификации пятно. Чтобы свести к минимуму воздействие ультрафиолета на извлечение шаг (шаг 3,6), использовать пятно ДНК, которые могут быть визуализированы под голубой возбуждения. Cool решение примерно 40 ° C и постепенно добавить 1 мл MgCl2 (1,3 М) при встряхивании. Литой гель и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре. Установите устройство электрофореза и налить холодной (4 ° C) идущий буфер (0,5 x TBE с 11 мм MgCl2) в поле гель. Поместите поле гель в ледяной воде ванны. Добавьте буфер загрузки в оригами образцы (6 x загрузки буфер содержит 15% polysucrose 400 и 0,25% бромфеноловый синий в воде). Загрузите образцы в скважинах с надлежащим объемом согласно гребень используется (например, 50 мкл для 8-Ну гребня толщина 1,5 мм). Запустите электрофорез 2 h на 80 V.Примечание: Чтобы характеризовать оригами и отдельные открытые и закрытые структуры, вместо 2% гель 1% и продлить время работы до 4 ч. Изображения гель с гель томографа (рис. 2). Используйте синий свет transilluminator для визуализации полосы, вырезать группы оригами, разгромить гель на парафина и экстракт жидкий. Урожайность восстановления — примерно на 40%. Пипетка жидкости в блок центробежного фильтра и спина на 3000 x g 5 мин измеряют поглощения раствора оригами на 260 Нм с УФ видимые (UV-VIS) спектрометра. Оценки концентрации оригами, используя коэффициент вымирания 1.3 x 108 M-1·cm-1.Примечание: Типичная концентрация раствора оригами после геля агарозы очистки составляет 1-2 Нм. Храните очищенную оригами шаблоны на 4 ° C для последующего использования. 4. синтез золото наностержни Примечание: Протокол для синтеза AuNR заимствован из предыдущих литературы40 с незначительными изменениями. Вымойте все посуда с aqua regia за 5 мин, промойте его водой, sonicate с ультрачистая вода и высушить его перед использованием. Подготовить 0,2 М hexadecyltrimethylammonium бромид (CTAB), 1 мм HAuCl4, 4 мм AgNO3, 64 мм L (+)-аскорбиновая кислота и 6 мм NaBH4. Используйте холодную воду (4 ° C) растворяют NaBH4 и держать его в холодильник на 4 ° C. Аскорбиновой кислоты раствор должен быть свежеприготовленные.Предупреждение: CTAB является опасным в случае контакта с кожей (раздражающие), зрительный контакт (раздражающие), при приеме внутрь и ингаляции. Носите подходящую защитную одежду. В случае недостаточной вентиляции носите подходящее респираторное оборудование. NaBH4 является чрезвычайно опасной в случае контакта с кожей (раздражающие), зрительный контакт (раздражающие), при приеме внутрь и ингаляции. Носите очки всплеск, лаборатории пальто, перчатки и респиратор паров и пыли. Убедитесь в том использовать утвержденные/сертифицированный респиратор или эквивалент. Подготовка семян Au. Добавьте в стеклянный флакон 500 мкл CTAB (0,2 М), 250 мкл ультрачистая вода и 250 мкл HAuCl4 (1 мм). Движение при 450 об/мин при комнатной температуре в течение 5 мин. Увеличьте скорость перемешивания до 1200 об/мин. 100 мкл холодного раствора NaBH4 (6 мм, 4 ° C). Через 2 мин остановить перемешивание и инкубировать решение в водяной бане при 30 ° C в течение 30 мин перед использованием. Подготовьте AuNRs. Растворите 0,55 г CTAB и 0,037 г 2,6-dihydroxybenzoic кислоты в 15 мл теплой воды (60-65 ° C) в раунд нижней колбе. Охладить вниз раствор до 30 ° C, 600 мкл AgNO3 (4 мм) и перемешать при 450 об/мин на 2 мин. Затем оставьте раствор ненарушенных 15 мин при температуре 30 ° C. В решение добавьте 15 мл HAuCl4 (1 мм) и движение при 450 об/мин за 15 мин добавить 120 мкл L (+)-аскорбиновая кислота (64 мм) и затем, сразу же, перемешать на 1200 об/мин за 30 с. Добавить 12 мкл Au семян и держите перемешивая при 1200 об/мин за 30 s. Инкубируйте решение в водяной бане при 30 ° C для 18 h. Не беспокоить решение и использовать шапку, чтобы закрыть колбу. Передать полученный раствор пробирок и центрифуги на 9500 x g 12 мин при 20 ° C. Отменить супернатанта, разогнать Пелле в 20 мл ультрачистая вода и выполнить еще один шаг центрифугирования. Разогнать окончательный гранулы в 3 мл дистиллированной воды. Оценки концентрации AuNRs от измерения поглощения UV-VIS, используя коэффициент вымирания для продольной плазмон резонанс. Коэффициент вымирания может быть предсказано с помощью AuNR форму параметров41. Магазин AuNRs на 4 ° C для дальнейшего использования. 5. функционализация золота наностержни одноцепочечной ДНК Примечание: Этот раздел описывает протокол для AuNR функционализация одноцепочечной ДНК (ssDNA), после так называемого низкого pH маршрут адаптировано из предыдущих литературы42. AuNRs, покрытые ДНК очищаются путем центрифугирования; Кроме того очистка может производиться с использованием геля агарозы. Проинкубируйте 20 мкл тиоловых функционализированных Мираж нитей ДНК (1 мм) с 20 мкл свежеприготовленный tris(2-carboxyethyl) фосфин гидрохлорид (TCEP, 14 мм) за 1 ч до уменьшения дисульфидными облигаций.Примечание: Тиоловых групп форме облигаций с AuNRs, и последовательность Мираж скрещивается с ручкой10 поля на оригами, в котором слишком много или слишком мало пар может привести к неисправности или нестабильная сборка.Предупреждение: TCEP могут вызвать серьезные ожоги кожи и повреждение глаз. Пользоваться защитными перчатками/защитной одеждой/глаз защиты/лица. Смесь 150 мкл AuNRs (10 Нм) и 40 мкл TCEP-лечение тиоловых-ДНК (0,5 мм). Добавьте 1% лаурилсульфат натрия (SDS) AuNR решение для достижения окончательного SDS концентрации 0,05%. Отрегулируйте пэ-аш до 2,5-3 с ~ 1 мкл HCl (1 М). Проинкубируйте втечение 2 ч при встряхивании в 70 об/мин.Примечание: AuNR-ДНК соотношение должно быть порядка 1:5 000-15 000, в зависимости от размера стержней. Для AuNRs (70 нм x 30 Нм) подготовлен протокол, описанные в разделе 4, 13000 избыток тиоловых ДНК рекомендуется следующее. Добавление NaCl достичь окончательного согласования NaCl 0,5 м и проинкубируйте 4 ч при комнатной температуре при встряхивании в 70 об/мин.Примечание: Изменение цвета на этом шаге может указывать неудачной функционализации ДНК. Отрегулируйте пэ-аш до ~8.5 с буфером КЭ (10 x) и инкубировать на ночь. Вымойте ДНК-AuNRs 4 x, смешивая образцы с 1 мл отмывающего буфера (0,5 x TBE с 0.1% SDS) и центрифуги на 7000 x g 30 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте ДНК-AuNRs в оставшейся жидкости (~ 40 мкл). Оценки концентрации ДНК-AuNRs от поглощения измерения UV-VIS, как описано в шаге 4.4.5.Примечание: Решение может стать немного облачно шагах 5.3-5.4 из-за замены CTAB от поверхности AuNRs тиоловых ДНК. Решение должно стать ясно, после потепления до ~ 35 ° C за 5 мин. 6. Ассамблея золото наностержни на ДНК оригами шаблоны Добавьте MgCl2 решение очищенная ДНК-AuNRs, до конечной концентрации 10 мм. Mix очищенная ДНК-AuNRs и оригами в соотношении 10:1.Примечание: Более низкий коэффициент может привести к снижению доходности продукта43. Отжиг в смесь в смесителе с контролем температуры от 40 ° C до 20 ° C при встряхивании в 400 об/мин, после процедуры в таблице 2.Примечание: Для характеризации CD, образец может быть измерена после этого шага без дальнейшей очистки. Электрофорез геля агарозы 0,7% (3,5 ч на 80 V) используйте, чтобы очистить окончательный оригами AuNR структуры. Используйте белый свет transilluminator для обработки изображений. Вырезать полосе продукта (димер оригами AuNR) (рис. 3), smash гель на парафина и экстракт жидкий. Дозатор жидкости в центробежный фильтр и спина на 3000 x g 5 мин Ресуспензируйте оригами AuNRs в растворе. Восстановления доходность от геля составляет примерно 50%. Оценки концентрации оригами AuNR структуры измерения поглощения UV-VIS, как описано в шаге 4.4.5. 7. Передача электронной микроскопии изображений Примечание: Этот формиат уранила (НЛО), окрашивание протокол приспособлен от предыдущих литературу44. Микс 200 мкл раствора НЛО (0,75%) и 1 мкл NaOH (5 М) и вихрь немедленно на 2-3 мин центрифуга пятно решение для 3-4 мин на 14 000 x g. Защитите пятно от воздействия света (например, заключив его в алюминиевую фольгу).Предупреждение: НЛО токсичен при вдыхании или проглатывании и может вызвать раздражение глаз. В случае кратковременного воздействия или низкой загрязнения используйте устройство респираторный фильтр. В случае интенсивного или длительного воздействия использования автономных дыхательных защитное устройство. Надевайте перчатки. Перчатка материал должен быть непроницаемыми и устойчивы к НЛО и его решения. Надевайте плотно закрытой очки. Тлеющий разряд углерода/formvar покрытием сетки ТЕА для 6 s непосредственно перед использованием увеличить гидрофильность и поощрять прилипания структур. Пипетка 5 мкл пример капель на сетке ТЕА, инкубировать для 5-8 мин и удалить падения нежно прикасаясь фильтровальной бумаги с краем сетки. Пипетка один большой (~ 20 мкл) и один маленький (~ 10 мкл) капли раствора пятно на парафина. Поставьте сетку на небольшое пятно решение падение и высушить немедленно, прикоснувшись фильтровальной бумаги с краем сетки. Затем положить его на большой пятно решение падение на 30 s. Удалите жидкость на сетке, прикоснувшись фильтровальной бумаги с края сетки. Поместите сетку в держателе сетки. Ждать для сетки для просушки на по крайней мере 10 мин. Охарактеризовать образцы оригами (рис. 4), AuNRs (рис. 5) и оригами AuNRs (рис. 6) к ТЕА. 8. циркулярного дихроизма измерение Очистите CD-спектрометр с N2 по 20 мин.Примечание: Большинство из CD спектрометры требуют очистки с N2 до зажигания лампы. Проверьте руководство спектрометр CD. Установка полосы пропускания, диапазон сканирования и приобретение шаг.Примечание: Диапазон сканирования зависит от оптические свойства AuNRs, которое зависит от размера AuNRs. Мера чистый компакт-диск с буфером. Измерьте CD спектры образцов оригами AuNR (рис. 7).Примечание: Используйте кварты или стеклянные кюветы для измерения CD. Пластиковый кюветы непригодны для CD спектроскопии. Кроме того большинство CD спектрометры позволяют одновременное приобретение поглощения и данных CD.