Montagem de Nanobastões de Ouro em Metamoléculas Plasmônicas Quirais Usando Modelos de Origami de DNA

1. projeto do origami DNA Identifica o arranjo espacial relativo desejado de AuNRs e a forma adequada do modelo de origami de DNA (Figura 1A). Estime os parâmetros estruturais do AuNRs e os modelos de origami. Localize as posições aproximadas dos agrafos que precisam de mais modificação (Figura 1B). Baixe e instale o circunflexo18 para a concepção de um modelo de origami de DNA. No circunflexo, rotear os andaime e grampo vertentes de acordo com a forma desejada do modelo e gerar a sequência de fibras descontínuas clicando Seq ferramenta. Clique em Ferramenta de pintura e marcar as fibras descontínuas que exigem maior modificação (Figura 1C). Clique na Ferramenta exportar para exportar as sequências de DNA descontínuas (Figura 1C) para um arquivo. csv. Projeto double-stranded bloqueios para corrigir o ângulo de Θ entre os dois feixes de origami. Dependendo da orientação relativa dos dois pacotes, construção de origami pode adaptar-se – ou mão esquerda direita (LH/RH) quiral configuração espacial (Figura 1B). Importe o arquivo. csv a staples para um aplicativo de planilha. Adicione uma sequência de10 polyA na extremidade dos grampos utilizados para montagem de AuNR (alças). Modifica as fibras descontínuas nos sites bloqueio projetado com sequências de bloqueio.Nota: Os assemblies nos resultados representativos contêm 36 alças salientes na extremidade 3′ dos fios descontínuas, 18 em cada pacote de origami de DNA, igualmente distribuídas em duas paralelas hélices cada 21 nt. A distância entre a primeira e a última posição do punho é 168 nt, aproximadamente 57 nm (consulte o arquivo anexado circunflexo). 2. montagem dos modelos de origami de DNA Prepare um estoque de trabalho de fibras descontínuas (SM), incluindo vertentes com alças e bloqueios, através da mistura de quantidades iguais de concentração normalizado oligonucleotides descontínuas (por exemplo,, 100 µM).Nota: Origami estruturas geralmente contêm várias centenas de fibras descontínuas. Staples são normalmente comprados de lojas especializadas na síntese química de oligonucleotídeos de DNA em multiwell (por exemplo, 96 poços) placas. Para 500 µ l de origami de nM 10, misture 50 µ l de Tris-EDTA (TE, 10x), 100 µ l de MgCl2 (100 mM), 25 µ l de NaCl (100 mM), 175 µ l de H2O, 100 µ l de SM (0,5 µM), 5 µ l de vertentes de bloqueio (5 µM) e um andaime de 50 µ l (100 nM). Recoze a mistura em um thermocycler de 80 ° C a 20 ° C, conforme descrito na tabela 1. 3. purificação de origami de DNA Nota: Esta seção descreve o protocolo para a purificação do gel de agarose. Modelos de origami de DNA também podem ser purificados usando abordagens alternativas38,39. Para o 1% gel, dissolver 1 g de agarose em 100 mL de Tris-borato-EDTA (TBE, 0.5 x) aquecendo a mistura em um forno de microondas. Adicione 10 µ l de 10.000 x DNA mancha de acordo com a especificação de mancha. Para minimizar a exposição à luz UV para a etapa de extração (passo 3.6), use uma mancha de DNA que pode ser visualizada sob excitação azul. Esfriar a solução para cerca de 40 ° C e lentamente, adicionar 1 mL de MgCl2 (1.3 M) agitando. Conversão de gel e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Definir o dispositivo de eletroforese e despeje buffer corrente de frio (4 ° C) (0.5 x TBE com 11 mM MgCl2) na caixa de gel. Coloque a caixa de gel em banho de água gelada. Adicione o amortecedor do carregamento para as amostras de origami (tampão de carregamento 6 x contém 15% polysucrose 400 e 0,25% bromofenol em água). Carrega as amostras em poços com um volume adequado de acordo com o pente usado (por exemplo,, 50 µ l para um pente 8 poços de 1,5 mm de espessura). Execute a eletroforese para 2h em 80 V.Nota: Para caracterizar o origami e separar a estrutura aberta e fechada, uso 2% gel em vez de 1% e prolongar o tempo de execução para 4 h. Imagem do gel com a câmera do gel (Figura 2). Use um transiluminador de luz azul para visualizar as bandas, cortar a banda de origami, esmagar o gel em um parafilm e extrair o líquido. O rendimento de recuperação é de aproximadamente 40%. Pipetar o líquido para uma unidade de filtro centrífugo e centrifugação a 3.000 x g por 5 min. medir a absorção da solução de origami em 260 nm com um espectrómetro de UV-visível (UV-VIS). Estime a concentração de origami usando um coeficiente de extinção de 1,3 x 108 M-1·cm-1.Nota: A concentração típica da solução de origami após purificação do gel de agarose é 1-2 nM. Armazene os modelos de origami purificado a 4 ° C para uso posterior. 4. síntese de ouro nanorods Nota: O protocolo para a síntese de AuNR é adaptado do anterior literatura40 com pequenas modificações. Lavar todos os copos com água régia por 5 min, enxague com água, proceda à sonicação é com água ultrapura e secá-lo antes de usar. Preparar a 0,2 M brometo de hexadeciltrimetilamónio (CTAB), 1mm HAuCl4, 4mm AgNO3, 64 mM L (+)-ácido ascórbico e 6 mM NaBH4. Use água fria (4 ° C) para dissolver NaBH4 e mantê-lo em uma geladeira a 4 ° C. Solução de ácido ascórbico deve ser preparados na hora.Cuidado: CTAB é perigoso em caso de contacto com a pele (irritante), contato com os olhos (irritante), inalação e ingestão. Use vestuário de protecção adequado. Em caso de ventilação insuficiente, use equipamento respiratório adequado. NaBH4 é extremamente perigosos em caso de contacto com a pele (irritante), contato com os olhos (irritante), inalação e ingestão. Use um respirador de vapor e poeira, um jaleco, luvas e óculos de mergulho. Certifique-se de usar um respirador aprovado/certificado ou equivalente. Prepare sementes Au. Adicione 500 µ l de CTAB (0,2 M), 250 µ l de água ultrapura e 250 µ l de HAuCl4 mM (1) dentro de um frasco de vidro. Misture a 450 rpm, à temperatura ambiente por 5 min. Aumente a taxa de agita a 1.200 rpm. Adicione 100 µ l de solução fria de4 NaBH (6 mM, 4 ° C). Depois de 2 min, pare a agitação e incubar a solução em um banho de água a 30 ° C por 30 min antes de usar. Prepare AuNRs. Dissolva 0,55 g de CTAB e 0,037 g de ácido 2,6-benzoico em 15 mL de água quente (60-65 ° C) em um balão de fundo redondo. Arrefecer a solução a 30 ° C, adicionar 600 µ l de AgNO3 (4 mM) e agitar a 450 rpm por 2 min. Então, deixe a solução imperturbada por 15 min a 30 ° C. Adicionar 15 mL de HAuCl4 mM (1) para a solução e agitar a 450 rpm por 15 min. Adicionar 120 µ l de L (+)-ácido ascórbico (64 mM), em seguida, imediatamente, misture a 1.200 rpm para 30 µ l de adicionar 12 s. de sementes de Au e continue mexendo a 1.200 rpm por 30 s. Incube a solução em um banho de água a 30 ° C, durante 18 h. Não perturbar a solução e usar um tampão para tapar o balão. Transferir a solução resultante para tubos de centrífuga e centrifugar a 9.500 x g por 12 min a 20 ° C. Desprezar o sobrenadante, dispersar a pelota em 20 mL de água ultrapura e executar mais de um passo de centrifugação. Disperse a pelota final em 3 mL de água destilada. Estime a concentração de AuNRs de uma medida de absorção UV-VIS utilizando o coeficiente de extinção para a ressonância plasmon longitudinal. O coeficiente de extinção pode ser predito usando AuNR forma parâmetros41. Armazene o AuNRs a 4 ° C para utilização posterior. 5. functionalization de ouro nanorods com ADN single-stranded Nota: Esta seção descreve o protocolo para AuNR functionalization com DNA de cadeia simples (ssDNA), seguindo a rota de so-called baixo pH adaptada do anterior literatura42. Os AuNRs cobertos com DNA são purificados por centrifugação; Alternativamente, a purificação pode ser executada usando a eletroforese em gel de agarose. Incubar a 20 µ l de polyT thiol-acrescida de DNA (1 mM) com 20 µ l de acabadas tris(2-carboxyethyl) cloridrato de fosfina (TCEP, 14 mM) por 1h reduzir as ligações de bissulfeto.Nota: O formulário de grupos tiol laços com AuNRs, e a sequência de polyT se com a alça de10 polyA sobre o origami, em que muitos ou poucos pares de base pode levar a um mau funcionamento ou uma montagem instável.Atenção: TCEP pode causar queimaduras graves e lesões oculares. Use luvas protetoras/protetor roupa/óculos de protecção de proteção/rosto. Mix 150 µ l de AuNRs (10 nM) e 40 µ l de thiol-DNA tratado TCEP (0,5 mM). Adicione 1% sulfato dodecyl de sódio (SDS) para a solução de AuNR para alcançar uma concentração final de SDS de 0,05%. Ajuste o pH a 2,5-3 com ~ 1 µ l de HCl (1 M). Incube durante 2 h, agitando a 70 rpm.Nota: A relação AuNR-para-DNA deve ser da ordem de 1:5, 000-15.000, dependendo do tamanho das barras. Para o AuNRs (70 nm, x 30 nm) preparado seguinte, recomenda-se o protocolo descrito na seção 4, um excesso de 13.000 de thiol-DNA. Adicione NaCl para alcançar uma concertação de NaCl final de 0,5 M e incubar durante 4 h à temperatura ambiente e agitando a 70 rpm.Nota: Uma mudança de cor nesta etapa pode indicar uma falha functionalization de DNA. Ajustar o pH a ~8.5 com amortecedor de TBE (10x) e incubar durante uma noite. Lave o DNA-AuNRs 4 x misturando as amostras com 1 mL de tampão de lavagem (0.5 x TBE com 0,1% SDS) e centrifugar 7.000 x g por 30 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o DNA-AuNRs no líquido remanescente (~ 40 µ l). Estime a concentração de DNA-AuNRs de uma medida de absorção UV-VIS, conforme descrito na etapa 4.4.5.Nota: A solução pode tornar-se ligeiramente turva em passos 5.3-5.4 devido a substituição do CTAB da superfície da AuNRs por thiol-DNA. A solução deve tornar-se evidente após aquecimento até ~ 35 ° C por 5 min. 6. montagem de ouro nanorods em modelos de origami de DNA Adicione a solução de DNA purificado-AuNRs, para uma concentração final de 10 mM MgCl2 . Misture o DNA-AuNRs purificado e origami para uma proporção de 10:1.Nota: Uma menor taxa pode diminuir o rendimento de produto43. Recoze a mistura na batedeira com um controle de temperatura de 40 ° C a 20 ° C e agitando a 400 rpm, seguindo o procedimento na tabela 2.Nota: Para a caracterização do CD, a amostra pode ser medida após esta etapa sem mais purificação. Use a electroforese do gel do agarose 0.7% (3,5 h a 80 V) para purificar as estruturas de origami-AuNR final. Use um transiluminador de luz branca para a imagem latente. Cortar a faixa de produto (dímero de origami-AuNR) (Figura 3), esmagar o gel em um parafilm e extrair o líquido. Pipeta o líquido em uma unidade de filtro centrífugo e centrifugação a 3.000 x g por 5 min. Ressuspender o origami-AuNRs na solução. O rendimento da recuperação do gel é aproximadamente 50%. Estime a concentração das estruturas de origami-AuNR de uma medida de absorção UV-VIS, conforme descrito na etapa 4.4.5. 7. imagem de microscopia eletrônica de transmissão Nota: Este formiato de uranilo (OVNI) protocolo de coloração é adaptado a partir de literatura anterior44. Mix de 200 µ l de solução de UFo (0,75%) e 1 µ l de NaOH (5m) e vórtice imediatamente para 2-3 min. centrifugar a solução mancha durante 3-4 minutos a 14.000 x g. Protege a mancha da exposição à luz (por exemplo, por envolvê-lo em papel alumínio).Cuidado: UFo é tóxico se inalado ou ingerido e pode causar irritação nos olhos. No caso de exposição breve ou baixa poluição, use um dispositivo de filtro respiratório. No caso de exposição intensa ou mais longa, use um dispositivo de protecção respiratório autónomo. Use luvas. O material da luva deve ser impermeável e resistente ao UFo e suas soluções. Use óculos de protecção firmemente selados. Brilho da descarga-grades TEM carbono/formvar-revestido para 6 s imediatamente antes da utilização para aumentar a Hidrofilia e promover a degola das estruturas. Pipetar 5 µ l amostra gotas na grelha TEM, incubar durante 5-8 min e remova a gota tocando suavemente num filtro de papel com a borda da grade. Pipete uma grande (~ 20 µ l) e um pequeno (~ 10 µ l) gota da solução em um parafilm mancha. Coloque a grelha sobre a mancha pequena gota de solução e seque imediatamente, tocando o papel de filtro com a borda da grade. Em seguida, colocá-lo na gota de solução a grande mancha por 30 s. Remova o líquido da grelha, tocando o papel de filtro com a borda da grade. Coloque a grelha no suporte de grade. Espere para a grade secar pelo menos 10 min. Caracteriza as amostras de origami (Figura 4), AuNRs (Figura 5) e origami-AuNRs pela TEM (Figura 6). 8. medição de Dicroísmo circular Purge o espectrómetro de CD com N2 por 20 min.Nota: A maioria os espectrómetros de CD exigem purga com N2 antes da ignição da lâmpada. Verifique no manual do espectrómetro de CD. Defina a largura de banda, intervalo de varredura e passo de aquisição.Nota: O intervalo de varredura depende das propriedades ópticas dos AuNRs, que dependem do tamanho da AuNRs. Medida em branco CD com buffer. Medir os espectros de CD de amostras de origami-AuNR (Figura 7).Nota: Use quarts ou cubetas de vidro para medição de CD. Cubetas plásticas são impróprias para espectroscopia de CD. Também, a maioria dos espectrômetros de CD permitem a aquisição simultânea de dados de CD e absorção.