Vergadering van gouden nanostaafjes in chirale Enterprise Metamolecules met behulp van DNA Origami sjablonen

1. ontwerp van de DNA-origami Bepaal de gewenste relatieve ruimtelijke rangschikking van AuNRs en de geschikte vorm van de DNA origami sjabloon(afbeelding 1). Schatten van de structurele parameters van de AuNRs en de origami-sjablonen. Zoek de geschatte posities van nietjes moeten verdere wijziging (Figuur 1B). Download en installeer caDNAno18 om een DNA-origami ontwerpsjabloon. In caDNAno, route de steiger en nieten strengen volgens de gewenste vorm van de sjabloon en de volgorde van stapelvezels strengen genereren door te klikken op Seq Tool. Klik op De knop Paint en markeer het nietje strengen die verder moeten worden gewijzigd (Figuur 1C). Klik op Hulpprogramma voor het exporteren als u wilt het nietje opeenvolgingen van DNA (Figuur 1C) exporteren naar een CSV-bestand. Double-stranded sloten vast de Θ van de hoek tussen de twee bundels van origami te ontwerpen. Afhankelijk van de relatieve stand van de twee bundels, kunt de origami-construct links – of rechtshandig (LH/RH) chirale ruimtelijke configuratie (Figuur 1B) aanpassen. De nietjes CSV-bestand importeren in een spreadsheetprogramma. Een reeks van polyA10 toevoegen aan het einde van de nietjes gebruikt voor AuNR montage (grepen). Wijzig de nietje strengen op de sites van de ontworpen slot met lock sequenties.Opmerking: De assemblages in de representatieve resultaten bevatten 36 handgrepen uitsteekt aan de 3′ einde van de staple strengen, 18 op elke DNA origami bundel, gelijkmatig verdeeld over twee parallelle helices elke 21 nt. De afstand tussen de eerste en de laatste positie van de greep is 168 nt, ongeveer 57 nm (Zie de bijgevoegde caDNAno-bestand). 2. montage van de DNA-origami-sjablonen Voorbereiden van een voorraad van de werken van stapelvezels strengen (SM), met inbegrip van strengen met grepen en sloten, door het mengen van gelijke hoeveelheden van concentratie-genormaliseerd nietje oligonucleotides (b.v., 100 µM).Opmerking: Origami structuren bevatten meestal enkele honderden nietje strengen. Nietjes worden meestal gekocht van leveranciers die zijn gespecialiseerd in de chemische synthese van DNA oligonucleotides in multiwell (bijv., 96-Wells) platen. Voor 500 µL van 10 nM origami, Meng 50 µL van Tris-EDTA (TE, 10 x), 100 µL van MgCl2 (100 mM), 25 µL van NaCl (100 mM), 175 µL van H2O, 100 µL van SM (0,5 µM), 5 µL van lock strengen (5 µM) , en een 50 µL steiger (100 nM). Ontharden het mengsel in een thermocycler van 80 ° C tot 20 ° C in tabel 1beschreven. 3. DNA origami zuivering Opmerking: Deze sectie beschrijft het protocol voor agarose gel zuivering. DNA origami sjablonen kunnen ook gezuiverd worden met behulp van alternatieve benaderingen38,39. Voor 1% gel, los 1 g agarose in 100 mL Tris-boraat-EDTA (TBE, 0,5 x) door verwarming van het mengsel in een magnetron. Voeg 10 µL van 10.000 x DNA stain volgens de specificatie van de vlek. Gebruiken om te minimaliseren van de blootstelling aan UV-licht op de extractie stap (3.6), een DNA-vlek die onder blauwe excitatie kan worden gevisualiseerd. Koel de oplossing tot ongeveer 40 ° C en voeg langzaam 1 mL MgCl2 (1.3 M) terwijl het schudden. Gegoten gel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Stel het apparaat elektroforese en giet er koud (4 ° C) lopende buffer (0,5 x TBE met 11 mM MgCl2) in het vak van de gel. Plaats de gel-vak in een waterbad van ijs. Laden buffer toevoegen aan de monsters van de origami (6 x laden buffer bevat 15% polysucrose 400 en 0,25% bromophenol blauw in water). Laad de monsters in de putjes met een juiste volume volgens de kam gebruikt (, bijvoorbeeld 50 µL voor een 8-well kam van 1,5 mm dikte). Voer de elektroforese gedurende 2 uur bij 80 V.Opmerking: Om te karakteriseren de origami en scheiden van de open en gesloten structuur, 2% gel gebruiken in plaats van 1% en de lopende tijd tot 4 h verlengen. Het imago van de gel met de gel imager (Figuur 2). Gebruik een blauwe lichte transilluminator te visualiseren van de banden, snijden de origami-band smash van de gel op een parafilm en uitpakken van de vloeistof. De herstel-opbrengst is ongeveer 40%. Pipetteer van de vloeistof in een centrifugaal filter eenheid en draai bij 3000 x g gedurende 5 min. meten van de absorptie van de origami-oplossing bij 260 nm met een UV-zichtbaar (UV-VIS) spectrometer. Schatting van de concentratie van origami met behulp van een aanpassingscoëfficiënt vast die uitsterven van 1.3 x 108 M-1-•cm-1.Opmerking: De typische concentratie van origami oplossing nadat agarose gel zuivering is 1-2 nM. De gezuiverde origami sjablonen bij 4 ° C voor later gebruik opslaan. 4. synthese van gouden nanostaafjes Opmerking: Het protocol voor AuNR synthese is aangepast uit de vorige literatuur40 met kleine wijzigingen. Alle glaswerk met koningswater gedurende 5 minuten wassen, spoelen met water, bewerk het ultrasone trillingen ten met ultrazuiver water en droog het vóór gebruik. Bereiden van 0,2 M hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), 1 mM HAuCl4, 4 mM AgNO3, 64 mM L (+)-ascorbinezuur, en 6 mM NaBH4. Gebruik koud water (4 ° C) te ontbinden NaBH4 en bewaar deze in een koelkast bij 4 ° C. Ascorbinezuur oplossing moet vers worden bereid.Let op: CTAB is gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), contact met de ogen (irriterend), via ingestie en inhalatie. Draag geschikte beschermende kleding. Bij ontoereikende ventilatie een geschikte adembescherming dragen. NaBH4 is zeer gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), contact met de ogen (irriterend), via ingestie en inhalatie. Draag splash bril, een laboratoriumjas, handschoenen en een gasmasker damp en stof. Zorg ervoor dat u een erkend/gecertificeerd gasmasker of een vergelijkbare groep. Au zaden voor te bereiden. Voeg 500 µL van CTAB (0,2 M), 250 µL van ultrazuiver water en 250 µL van HAuCl4 (1 mM) in een glazen ampul. Roer op 450 rpm bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. De opzwepende verhogen tot 1.200 tpm. Voeg 100 µL van koude NaBH4 oplossing (6 mM, 4 ° C). Na 2 minuten, stop de roeren en Incubeer de oplossing in een waterbad bij 30 ° C gedurende 30 minuten vóór gebruik. AuNRs voor te bereiden. Ontbinden 0.55 g CTAB en 0.037 g van 2,6-dihydroxybenzoic zuur in 15 mL warm water (60-65 ° C) in een rondbodemkolf. De oplossing tot 30 ° C afkoelen, voeg 600 µL van AgNO3 (4 mM) en roer bij 450 omwentelingen per minuut gedurende 2 minuten. Dan, laat de oplossing ongestoord gedurende 15 minuten staan bij 30 ° C. Voeg toe 15 mL HAuCl4 (1 mM) aan de oplossing, en roer bij 450 rpm voor 15 min. 120 toevoegen µL van L (+)-ascorbinezuur (64 mM), en vervolgens onmiddellijk, roer op 1.200 rpm voor 30 s. Voeg 12 µL van Au zaden en Blijf roeren op 1.200 rpm voor 30 s. Incubeer de oplossing in een waterbad bij 30 ° C gedurende 18 h. Niet storen van de oplossing en gebruik een dop te sluit de kolf of fles. Breng de resulterende oplossing centrifuge buizen en centrifuge 9.500 x g gedurende 12 minuten bij 20 ° C. Verwijder het supernatant, verspreiden de pellet in 20 mL ultrazuiver water en één meer centrifugeren stap uitvoeren. Het verspreiden van de laatste pellet in 3 mL gedestilleerd water. Schatting van de concentratie van AuNRs van een UV-VIS absorptie metingen met behulp van de coëfficiënt van uitsterven voor de longitudinale plasmon resonantie. De coëfficiënt uitsterven kan worden voorspeld met behulp van de AuNR vorm parameters41. Bewaar de AuNRs bij 4 ° C voor verder gebruik. 5. functionalization van gouden nanostaafjes met single-stranded DNA Opmerking: Deze sectie beschrijft het protocol voor AuNR functionalization met single-stranded DNA (ssDNA), na de zogenaamde lage pH-route aangepast uit de vorige literatuur42. Het AuNRs bedekt met DNA zijn gezuiverd door middel van centrifugeren; u kunt ook kan de zuivering worden uitgevoerd met behulp van de Elektroforese van het gel van de agarose. Incubeer 20 µL van thiol-matiemaatschappij polyT DNA-strengen (1 mM) met 20 µL van vers bereide tris(2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride (TCEP, 14 mM) voor 1 h om disulfide bindingen.Opmerking: De vorm van de groepen thiol obligaties met AuNRs, en de reeks polyT hybridizes met de polyA10 greep op de origami, waarin te veel of te weinig basenparen tot een storing of een unstable vergadering leiden kan.Let op: TCEP kan ernstige huid brandwonden en oog schade veroorzaken. Draag beschermende handschoenen/beschermende kleding/oogbescherming bescherming/voor het gezicht. Mix 150 µL van AuNRs (10 nM) en 40 µL van TCEP-behandelde thiol-DNA (0.5 mM). 1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) toevoegen aan de oplossing van de AuNR voor het bereiken van een SDS-eindconcentratie van 0,05%. Breng de pH aan 2.5-3 met ~ 1 µL van HCl (1 M). Incubeer gedurende 2 h terwijl het schudden bij 70 t/min.Opmerking: De AuNR-naar-DNA-verhouding moet in de volgorde van 1:5, 000-15.000, afhankelijk van de grootte van de wikkels. Voor de AuNRs (70 nm x 30 nm) bereid volgende het protocol beschreven in sectie 4, een overtollige 13.000 van thiol-DNA is aanbevolen. Toevoegen van NaCl om te bereiken van een definitieve NaCl-overleg van 0,5 M en incubeer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur tijdens het schudden bij 70 t/min.Opmerking: Een kleurverandering bij deze stap kan duiden op een defecte DNA-functionalization. Breng de pH op ~8.5 met FSME buffer (10 x) en na een nacht bebroeden. Wassen van de DNA-AuNRs 4 x door het mengen van de monsters met 1 mL buffer te wassen (0,5 x TBE met 0,1% SDS), en centrifugeer bij 7.000 x g gedurende 30 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de DNA-AuNRs in de resterende vloeistof (~ 40 µL). Schatting van de concentratie van DNA-AuNRs van een UV-VIS absorptie metingen zoals beschreven in stap 4.4.5.Opmerking: De oplossing zou kunnen worden iets ‘troebel’ stappen 5.3-5.4 als gevolg van de CTAB vervanging van het oppervlak van de AuNRs door thiol-DNA. De oplossing moet worden duidelijk op de opwarming van de aarde tot ~ 35 ° C gedurende 5 minuten. 6. montage van gouden nanostaafjes op DNA origami sjablonen Voeg MgCl2 toe aan de oplossing van gezuiverde DNA-AuNRs, om een eindconcentratie van 10 mM. Meng de gezuiverde DNA-AuNRs en origami naar een verhouding 10:1.Opmerking: Een lagere ratio kan het product opbrengst43afnemen. Ontharden het mengsel in een mixer met een temperatuur van 40 ° C tot 20 ° C terwijl het schudden bij 400 rpm, overeenkomstig de procedure van tabel 2.Opmerking: Voor de karakterisering van de CD, de steekproef kan worden gemeten na deze stap zonder verdere zuivering. 0,7% agarose gelelektroforese (3,5 h bij 80 V) gebruiken voor het zuiveren van de definitieve origami-AuNR-structuren. Gebruik een witte lichte transilluminator voor imaging. Snijd de product band (origami-AuNR dimeer) (Figuur 3), smash van de gel op een parafilm, en haal de vloeistof. Pipetteer de vloeistof in een centrifugaal filter eenheid en de spin bij 3000 x g gedurende 5 min. resuspendeer de origami-AuNRs in de oplossing. De opbrengst van de terugwinning van de gel is ongeveer 50%. Schatting van de concentratie van de origami-AuNR structuren van een UV-VIS absorptie metingen zoals beschreven in stap 4.4.5. 7. Transmissie Electronenmicroscopie imaging Opmerking: Deze uranyl formate (UFo) kleuring protocol is aangepast uit de vorige literatuur44. Mix-200 µL van UFo oplossing (0,75%) en 1 µL van NaOH (5 M) en vortex onmiddellijk voor 2-3 min. de vlek oplossing voor 3-4 min bij 14.000 x gcentrifugeren. De vlek behoeden door blootstelling aan licht (bijvoorbeeld door het te verpakken in aluminiumfolie).Let op: UFo is giftig als ingeademd of ingeslikt en leiden irritatie van de ogen tot kan. In het geval van kortstondige blootstelling of lage vervuiling, een respiratoire filter-apparaat te gebruiken. In het geval van intensieve of langere blootstelling, een self-contained respiratoire beschermende apparaat te gebruiken. Draag handschoenen. Het handschoenmateriaal moet waterdicht en bestand tegen UFo en haar oplossingen. Strak verzegelde bril dragen. Gloed-kwijting koolstof/formvar-gecoate TEM rasters voor 6 s net voor gebruik verhogen hydrophilicity en bevorderen de steken van de structuren. Pipetteer 5 µL monster druppels op de grid TEM, Incubeer gedurende 5-8 minuten en verwijder de daling door zachtjes aan te raken een filtreerpapier met de rand van het raster. Pipetteer een grote (~ 20 µL) en één kleine (~ 10 µL) drop van de oplossing van de vlek op een parafilm. Zet het raster op de daling van de oplossing van de kleine vlek en droog onmiddellijk door het aanraken van het filtreerpapier met de rand van het raster. Dan, zet het op de daling van de oplossing van het grote vlek voor 30 s. Verwijder de vloeistof op de grid door het aanraken van het filtreerpapier met de rand van het raster. Schakel het raster in de raster-houder. Wachten op de grid voor ten minste 10 min. drogen. Kenmerkend zijn de monsters van origami (Figuur 4), AuNRs (Figuur 5) en origami-AuNRs (Figuur 6) door TEM. 8. circulair dichroïsme meting Verwijderen van de CD-spectrometer met N2 voor 20 min.Opmerking: De meeste van de CD-spectrometers nodig zuiveren met N2 vóór lamp ontsteking. Raadpleeg de handleiding van de spectrometer CD. De bandbreedte, scannen bereik en overname stap instellen.Opmerking: Het scannen bereik hangt af van de optische eigenschappen van AuNRs, die afhankelijk van de grootte van de AuNRs. Maatregel lege CD met buffer. Het meten van de spectra van de CD van origami-AuNR monsters (Figuur 7).Opmerking: Gebruik quarts of glas cuvettes voor meting van de CD. Kunststof cuvettes zijn ongeschikt voor CD spectroscopie. Ook, de meeste CD-spectrometers toestaan de gelijktijdige overname van absorptie en gegevens van de CD.