Altın Nanorods bütünleştirilmiş koda kiral Plazmonik Metamolecules DNA Origami şablonlarını kullanma

1. tasarım DNA Origamisi AuNRs istenen göreli kayma düzenlenmesi ve DNA origami şablonu (şekil 1A) uygun şeklini tanımlar. AuNRs ve origami şablonları yapısal parametrelerini tahmin etmek. Daha fazla değişiklik (şekil 1B) ihtiyacınız zımba yaklaşık konumunu bulun. Karşıdan yükleyip bir DNA origami şablonu tasarlamak için caDNAno18 . CaDNAno, iskele ve elyaf iplikçiklerinin birbirine şablonu istediğiniz şekli göre yönlendirmek ve elyaf iplikçikleri sıra Seq aracınıtıklatarak oluşturun. Boya aracını tıklatın ve daha fazla değişiklik (şekil 1C) gereken zımba ipliklerini işaretleyin. DNA zımba dizileri (şekil 1C) bir .csv dosyasına vermek için Verme aracı tıklatın. Çift iplikçikli kilitleri iki origami paketler arasındaki açı Θ düzeltmek için tasarım. İki demetleri göreli yönünü bağlı olarak, origami yapı sol veya sağ el (LH/RH) kiral kayma yapılandırma (şekil 1B) uyarlayabilirsiniz. Zımba .csv dosyasını bir elektronik tablo uygulaması alın. AuNR montaj (tutamaçları) için kullanılan zımba sonundaki polyA10 sıra ekleyin. Kilit serileri ile tasarlanmış kilit sitelerde zımba ipliklerini değiştirin.Not: Temsilcisi sonuçları derlemelerde kolları 3′ sonunda zımba iplikçiklerinin çıkıntılı, 18 tarihinde iki eşit dağıtılmış her DNA origami paket paralel sarmal her 21 36 içeren nt. 168 ilk ve son kolu konumu arasındaki mesafedir nt, yaklaşık 57 nm (ekli caDNAno dosyasına bakın). 2. derleme DNA origami şablonları Elyaf oligonucleotides (örneğin, 100 µM) konsantrasyon normalleştirilmiş eşit miktarda karıştırılarak iplikçikleri kolları ve kilitleri, ile de dahil olmak üzere bir çalışma hisse senedi (SM), zımba iplikçiklerinin hazırlayın.Not: Origami yapılar genellikle elyaf iplikleri yüzlerce içerir. Zımba genellikle DNA oligonucleotides kimyasal sentez içinde multiwell içinde uzmanlaşmış (örneğin, 96-da) satıcılardan satın plakaları. Tris-EDTA (TE, 10 x), 100 µL MgCl2 (100 mM), NaCl (100 mM), 175 µL H2O, 100 µL SM 25 µL 50 µL için 500 µL 10 nM origami mix (0.5 µM), (5 mikron) kilit iplikçiklerinin 5 µL ve bir 50 µL İskele yapısı-İskele (100 nM). Tablo 1′ de açıklandığı gibi bir thermocycler 80 ° c-20 ° c karışımı tavlamak. 3. DNA origami arıtma Not: Bu bölümde özel jel arıtma protokolünü açıklar. DNA origami şablonları da alternatif yaklaşımlar38,39kullanarak saf. Özel Tris-Bor-EDTA 100 ml 1 g için % 1 jel, dağıtılması (TBE, 0.5 x) karışımı fırın mikrodalga bir de Isıtma tarafından. DNA leke leke özelliğine göre 10.000 x 10 µL ekleyin. UV ışık ayıklama adımda (Adım 3.6) maruz en aza indirmek için altında mavi uyarma görselleştirildiği bir DNA leke kullanın. Çözüm yaklaşık 40 ° c serin ve yavaş yavaş MgCl2 (1.3 M) 1 mL sallayarak süre ekleyin. Jel döküm ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya. Elektroforez cihazı ve soğuk (4 ° C) çalışan arabellek dökün (0,5 ile 11 mM MgCl2x TBE) jel kutusu içine. Bir buz su banyosu jel kutusunda bir yer. Yükleme arabellek (6 x yükleme arabellek % 15 polysucrose 400 ve %0.25 bromophenol suda mavi içerir) origami örnekleri ekleyin. Wells ile kullanılan tarak (örneğin, 50 µL 1,5 mm kalınlıkta bir 8-iyi tarak için) göre uygun bir birim içine örnekleri yükleyin. Elektroforez 2s için 80 V çalıştırın.Not: origami karakterize ve açık ve kapalı yapısı ayırmak için yerine % %1 2 jel kullanımı ve 4 h için çalışma süresi uzatmak. Jel jel Imager (Şekil 2) ile görüntü. Mavi bir ışık transilluminator bantları görselleştirmek, origami bant kesmek, bir parafilm jel şut ve sıvı ayıklamak için kullanın. Yaklaşık kurtarma verimidir. Sıvı santrifüj filtre ünitesine pipette ve 3000 x g 5 dakika süreyle spin ölçmek origami çözüm 260 emilimini nm UV-görünür (UV-VIS) bir Spektrometre ile. Bir nesli katsayısı 1,3 108 M-1·cm-1x kullanarak origami konsantrasyonu tahmin ediyoruz.Not: Tipik özel jel sonra arıtma origami çözüm 1-2 nM bölgedir. Daha sonra kullanmak için 4 ° C’de arıtılmış origami şablonlarını depolamak. 4. altın nanorods sentezi Not: Önceki edebiyat40 küçük değişiklikler ile iletişim kuralı AuNR sentez için uyarlanmıştır. Aqua regia için 5 dk ile tüm cam yıkama, su ile durulayın, ultrasaf su ile solüsyon içeren temizleyicide ve kullanmadan önce kuru. 0.2 M hexadecyltrimethylammonium bromür (CTAB), 1 mM HAuCl4, 4 mM AgNO3, 64 mM L (+) hazırlamak-askorbik asit ve 6 mM NaBH4. NaBH4 dağıtılması ve 4 ° C’de bir buzdolabında tutmak için soğuk su (4 ° C) kullanın Askorbik asit çözüm taze hazırlanmış gerekir.Dikkat: CTAB cilt teması (tahriş edici), göz teması (tahriş edici), sindirim ve inhalasyon durumunda zararlıdır. Uygun koruyucu giysi giyin. Yetersiz havalandırma durumunda uygun solunum cihazı tak. NaBH4 cilt teması (tahriş edici), göz teması (tahriş edici), sindirim ve inhalasyon durumunda son derece zararlıdır. Splash gözlük, önlük, eldiven ve buharı ve toz solunum giymek. Bir gaz maskesi onaylı/sertifikalı veya eşdeğer kullandığınızdan emin olun. Au tohum hazırlayın. CTAB (0.2 M), 250 µL ultrasaf su ve 250 µL HAuCl4 (1 mM) 500 µL bir cam şişe ekleyin. 5 min için oda sıcaklığında 450 rpm’de karıştırın. 1200 rpm karıştırma oranı artırmak. Çözümün soğuk NaBH4 (6 mM, 4 ° C) 100 µL ekleyin. 2 dakika sonra karıştırma durdurmak ve bir su banyosu için kullanmadan önce 30 dk 30 ° C’de çözümde kuluçkaya. AuNRs hazırlayın. 0.55 g CTAB ve 15 mL sıcak su (60-65 ° C) 2,6-dihidroksibenzoik asit 0,037 g bir yuvarlak alt şişeye geçiyoruz. Çözüm ile 30 ° C arasında sakin, AgNO3 (4 mM) 600 µL ekleyin ve 450 devirde 2 dakika karıştırın. O zaman, 30 ° C’de çözüm 15dk için rahatsız bekletin HAuCl4 (1 mM) 15 mL ekleyin ve 15 dk. Ekle 120 µL m (+) için 450 rpm’de karıştırın-askorbik asit (64 mM), o zaman, hemen, 30 s. Ekle 12 µL Au tohum için 1200 rpm karıştırın ve 30 için 1200 rpm karıştırmaya devam s. Bir su banyosu için 18 h 30 ° C’de çözümde kuluçkaya. Çözüm rahatsız değil ve bir kap şişeye kapatmak için kullanın. Santrifüj tüpleri ve 12 dk 20 ° C’de için 9.500 x g , santrifüj sonuç çözüm transfer Süpernatant atmak, pelet ultrasaf su 20 ml dağıtmak ve adım daha aralıklarla gerçekleştirmek. 3 mL distile su içinde son Pelet dağıtmak. AuNRs konsantrasyonu için boyuna plasmon rezonans tükenme katsayısı kullanarak UV-VIS emme ölçüm üzerinden tahmin ediyoruz. Geçersiz kalma katsayısı AuNR şekil parametreleri41kullanarak tahmin edilebilir. AuNRs daha fazla kullanım için 4 ° C’de depolayın. 5. altın nanorods functionalization tek iplikçikli DNA ile Not: Önceki edebiyat42uyarlanmıştır sözde düşük pH rota takip protokolü ile tek iplikçikli DNA (ssDNA), AuNR functionalization için bu bölümde açıklanmaktadır. DNA ile kaplı AuNRs Santrifüjü tarafından saf; Alternatif olarak, arıtma özel Jel Elektroforez kullanılarak gerçekleştirilebilir. 20 µL thiol functionalized polyT DNA iplikçiklerinin (1 mM) ile taze hazırlanmış, 20 µL kuluçkaya tris(2-carboxyethyl) fosfamin hidroklorür (TCEP, 14 mM) disülfür bağları azaltmak 1 h için.Not: Thiol grupları formu AuNRs ile Tahvil ve çok fazla veya çok az baz çifti bir arıza veya kararsız derleme açabilir origami polyA10 saplı polyT sıra hybridizes.Dikkat: TCEP şiddetli cilt yanıkları ve göz zarar neden olabilir. Koruyucu eldiven/koruyucu giyim/göz koruma/yüz koruma giymek. AuNRs Mix 150 µL (10 nM) ve 40 µL TCEP tedavi thiol-DNA (0.5 mM). % 1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) % 0.05 son SDS konsantrasyon ulaşmak için AuNR ekleyin. PH 2.5-3 ~ 1 µL HCL (1 M) ile ayarlayın. 2s için 70 devir / dakikada sallayarak süre kuluçkaya.Not: AuNR DNA oranı 1:5, 000-15000, çubuklar büyüklüğüne bağlı olarak sırasına göre olmalıdır. AuNRs için (70 nm x 30 nm) hazırlanan aşağıdaki thiol-DNA, 4, 13.000 aşırı bölümünde açıklanan Protokolü önerilir. Son bir NaCl concertation 0.5 m ulaşmak ve 70 devir / dakikada sallayarak süre oda sıcaklığında 4 h için kuluçkaya NaCl ekleyin.Not: Bu adımda bir renk değişimi başarısız DNA functionalization gösterebilir. Gecede kuluçkaya ve pH TBE tampon (10 x) ile ~8.5 için ayarlayın. DNA-AuNRs 4 yıkama örnekleri arabellek yıkama 1 mL ile karıştırma tarafından x (%0,5 0,1 SDS ile x TBE) ve 30 dk. 7000 x g de süpernatant kaldırmak ve DNA AuNRs kalan sıvı (~ 40 µL) resuspend santrifüj. DNA-AuNRs konsantrasyonu bir UV-VIS emme ölçüm üzerinden 4.4.5 adımda anlatıldığı gibi tahmin ediyoruz.Not: Çözüm biraz ‘bulutlu’ adımlar 5,3 5,4 CTAB değiştirme nedeniyle AuNRs yüzey thiol-DNA tarafından haline gelebilir. Çözüm ~ 35 ° C’ye kadar 5 min için ısınma üzerine açık olmak. 6. altın nanorods DNA origami şablonları Meclisi MgCl2 saf DNA-AuNRs, 10 mM son bir konsantrasyon için çözüm ekleyin. Saf DNA-AuNRs ve origami 10:1 oranı için karıştırın.Not: Ürün verim43daha düşük bir oranı düşebilir. Bir mikser 40 ° C sıcaklık denetiminden 20 ° c ile karışımı 400 rpm, aşağıdaki Tablo 2′ deki yordamı sallayarak süre tavlamak.Not: CD karakterizasyonu için örnek sonra bu adımı daha fazla arıtma olmadan ölçülebilir. Son origami-AuNR yapıları arındırmak için % 0.7 özel Jel Elektroforez (80 V 3,5 h) kullanın. Beyaz bir ışık transilluminator görüntüleme için kullanın. Ürün grubu (origami-AuNR dimer) kesme (şekil 3), bir parafilm jel şut ve sıvı ayıklayın. Pipet sıvı santrifüj filtre ünitesi ve 3000 x g 5 dakika süreyle spin içine çözümde origami-AuNRs Resuspend. Yaklaşık % 50 jel gelen kurtarma verimidir. UV-VIS emme ölçüm origami-AuNR yapılardan konsantrasyonu 4.4.5 adımda anlatıldığı gibi tahmin ediyoruz. 7. iletim elektron mikroskobu görüntüleme Not: Bu uranyl Format (UFo) protokolü boyama önceki edebiyat44uyarlanmıştır. Mix 200 µL UFo çözüm (%0,75) ve 1 µL NaOH (5 M) ve girdap hemen 2-3 dakika süreyle santrifüj kapasitesi 14.000 x gde 3-4 dk için leke çözüm. Leke (örneğin, bu alüminyum folyo sarma tarafından) ışık pozlama korumak.Dikkat: UFo inhale veya yuttu ve göz tahrişine neden olabilir zehirli. Kısa maruz kalma veya düşük kirliliği durumunda, bir solunum filtre aygıtı kullanın. Kurslarımız yoğunlaştırılmış ya da daha uzun pozlama söz konusu olduğunda, kendi kendine yeten bir solunum koruma cihazı kullanın. Eldiven giymek. Eldiven malzeme geçirimsiz ve UFo ve çözümleri için dayanıklı olmalı. Sıkı kapalı giyim gözlük. Parlaklık-karbon/formvar-kaplı TEM Izgaralar 6 için deşarj s hydrophilicity artırmak ve yapıları yapışmasını teşvik sadece kullanmadan önce. 5 µL örnek damla TEM ızgara üzerinde pipet, 5-8 dk için kuluçkaya ve filtre kağıdı kılavuz kenarıyla hafifçe dokunarak açılır kaldırın. Bir damla büyük (~ 20 µL) ve küçük (~ 10 µL) bir parafilm üzerinde leke çözümün pipet. Kılavuz küçük leke çözüm teslimi koymak ve hemen filtre kağıdı kılavuz kenarıyla dokunarak kuru. O zaman, üstünde belgili tanımlık büyük leke çözüm damla 30 koymak s. Sıvı çizgilerini kılavuz kenarıyla filtre kağıdı dokunarak kaldırın. Kılavuz kılavuz tutucuya yerleştirin. En az 10 dk kurumaya kılavuz için bekleyin. Origami (şekil 4), AuNRs (şekil 5) ve origami-AuNRs (şekil 6) tarafından TEM örnekleri karakterize. 8. dairesel dichroism ölçüm N2 20 dk için CD Spektrometre temizle.Not: Çoğu CD Spektrometreler, N2 lamba ateşleme önce tasfiye gerektirir. CD Spektrometre el kitabına bakın. Bant genişliği, tarama aralığı ve satın alma adım ayarlayın.Not: AuNRs boyutuna bağlıdır AuNRs optik özelliklerini tarama aralığı bağlıdır. Ölçü birimi ile arabellek boş CD. Origami-AuNR örnekleri (Şekil 7) CD spectra ölçmek.Not: Quart veya cam cuvettes CD ölçüm için kullanın. Plastik cuvettes CD spektroskopisi için uygun. Ayrıca, çoğu CD Spektrometreler emme ve CD verilerini aynı anda satın izin ver.