Assemblage de Nanotiges or dans Metamolecules plasmoniques chiraux, à l’aide de modèles d’Origami ADN

1. conception de l’origami ADN Identifier la disposition spatiale relative souhaitée de AuNRs et la forme appropriée de la matrice d’origami ADN (Figure 1A). Estimer les paramètres structuraux de la AuNRs et les modèles d’origami. Localiser la position approximative d’agrafes nécessitant de nouveaux modification (Figure 1B). Téléchargez et installez caDNAno18 pour concevoir un modèle d’origami ADN. Dans caDNAno, faites passer les brins échafaudage et agrafe selon la forme désirée du modèle et générer la séquence de brins discontinues en cliquant sur Outil Seq. Cliquez sur Outil de peinture et marquer les brins discontinues qui nécessitent davantage de modification (Figure 1C). Cliquez sur l’ Outil d’exportation pour exporter les séquences discontinues (Figure 1C) vers un fichier .csv. Concevoir des écluses doubles brins pour fixer l’ angle Θ entre les deux forfaits origami. Selon l’orientation relative des deux faisceaux, la construction de l’origami peut adapter left ou right handed (LH/RH) chiral configuration spatiale (Figure 1B). Importer fichier .csv des agrafes dans un tableur. Ajouter une séquence de10 polyA à la fin des agrafes utilisées pour l’assemblage AuNR (poignées). Modifier les brins discontinues sur les sites de verrouillage conçus avec des séquences de verrouillage.Remarque : Les assemblys dans les résultats représentatifs contiennent 36 poignées en saillie à l’extrémité 3′ des brins discontinues, 18 sur chaque forfait origami ADN, répartie sur deux hélices en parallèle chaque 21 nt. La distance entre la première et la dernière position de la poignée est 168 nt, environ 57 nm (voir le fichier ci-joint caDNAno). 2. montage des modèles origami ADN Préparation d’un stock de travail des brins discontinues (SM), y compris les brins avec poignées et serrures, en mélangeant des quantités égales d’oligonucléotides discontinues concentration normalisée (par exemple, 100 µM).Remarque : Les structures Origami contiennent généralement plusieurs centaines de brins discontinues. Agrafes sont généralement achetés auprès de fournisseurs spécialisés dans la synthèse chimique d’oligonucléotides d’ADN en multiwell (p. ex., 96 puits) plaques. Pour 500 µL de 10 origami nM, mélanger 50 µL de Tris-EDTA (TE, 10 x), de 100 µL de MgCl2 (100 mM), de 25 µL de NaCl (100 mM), 175 µL d’H2O, 100 µL de SM (0,5 µM), 5 µL de brins de verrouillage (5 µM) et un échafaudage 50 µL (100 nM). Recuire le mélange dans un thermocycleur de 80 ° C à 20 ° C comme indiqué dans le tableau 1. 3. purification d’origami ADN Remarque : Cette section décrit le protocole pour la purification de gel d’agarose. Modèles d’origami ADN peuvent également être purifiés à l’aide de moyens38,,39. Pour 1 % gel, dissoudre 1 g d’agarose dans 100 mL de Tris-borate-EDTA (TBE, 0,5 x) en chauffant le mélange dans un four à micro-ondes. Ajouter 10 µL de 10 000 x ADN tache conformément à la spécification de la tache. Pour minimiser l’exposition aux rayons ultraviolets à l’étape d’extraction (étape 3.6), utiliser une tache d’ADN qui peut être visualisée sous excitation bleue. Refroidir la solution à environ 40 ° C et ajouter lentement 1 mL de MgCl2 (1,3 M) et en agitant. Monter le gel et incuber 30 min à température ambiante. La valeur de l’appareil d’électrophorèse et verser froid (4 ° C) tampon en cours d’exécution (0,5 x TBE avec 11 mM MgCl2) dans la boîte de gel. Placez la zone de gel dans un bain d’eau glacée. Tampon de charge s’ajoute les échantillons d’origami (6 x chargement mémoire tampon contient 15 % polysucrose 400 et 0,25 % de bleu de bromophénol dans l’eau). Charger les échantillons dans les puits avec un bon volume selon le peigne utilisé (par ex., 50 µL pour un peigne de 8 puits de 1,5 mm d’épaisseur). Exécutez l’électrophorèse pendant 2 h à 80 V.Remarque : Pour caractériser l’origami et séparer la structure ouverte et fermée, utiliser un gel 2 % au lieu de 1 % et prolonger la durée de 4 h. Image le gel avec l’imageur de gel (Figure 2). Un transilluminateur lumière bleu permet de visualiser les bandes, couper la bande origami, casser le gel sur une parafilm et extraire le liquide. Le rendement de récupération est d’environ 40 %. Pipeter le liquide dans une unité de filtration centrifuge et essorage à 3 000 x g pendant 5 min. mesurer l’absorption de la solution d’origami à 260 nm avec un spectromètre UV-visible (UV-VIS). Estimation de la concentration de l’origami en utilisant un coefficient d’extinction de 1,3 x 108 M-1·cm-1.Remarque : La concentration typique d’origami solution après purification de gel agarose est : 1-2. Stocker les modèles d’origami purifiée à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. 4. synthèse des nanotiges en or Remarque : Le protocole pour la synthèse de AuNR est adapté du précédent littérature40 avec des modifications mineures. Laver toute la verrerie avec eau régale pendant 5 min, rincer à l’eau, laisser agir il avec de l’eau ultrapure et sécher avant utilisation. Préparer le bromure d’hexadécyltriméthylammonium 0,2 M (CTAB), 1 mM HAuCl4, 4 mM AgNO3, 64 mM L (+)-acide ascorbique et 6 mM NaBH4. Utilisez l’eau froide (4 ° C) pour dissoudre NaBH4 et conservez-le au réfrigérateur à 4 ° C. Solution d’acide ascorbique doit être fraîchement préparé.Attention : CTAB est dangereux en cas de contact cutané (irritant), contact avec les yeux (irritant), ingestion et inhalation. Porter des vêtements protecteurs appropriés. En cas de ventilation insuffisante, porter un appareil respiratoire approprié. NaBH4 est extrêmement dangereux en cas de contact cutané (irritant), contact avec les yeux (irritant), ingestion et inhalation. Portez anti-éclaboussures, une blouse de laboratoire, des gants et un appareil respiratoire de vapeur et la poussière. N’oubliez pas d’utiliser un respirateur approuvé/accrédité ou l’équivalent. Préparer les graines de l’UA. Ajouter 500 µL de CTAB (0,2 M), 250 µL d’eau ultrapure et 250 µL de HAuCl4 (1 mM) dans un flacon en verre. Remuer à 450 tr/min à température ambiante pendant 5 min. Augmenter la vitesse en remuant à 1 200 tr/min. Ajouter 100 µL de solution de4 NaBH froide (6 mM, 4 ° C). Après 2 min, arrêter l’agitation et incuber la solution dans un bain d’eau à 30 ° C pendant 30 min avant utilisation. Préparer AuNRs. Dissoudre 0,55 g de CTAB et 0,037 g d’acide de 2, 6-dihydroxybenzoïque dans 15 mL d’eau chaude (60-65 ° C) dans un ballon à fond rond. Refroidir la solution à 30 ° C, ajouter 600 µL de AgNO3 (4 mM) et remuer à 450 tr/min pendant 2 min. Ensuite, laisser la solution reposer pendant 15 min à 30 ° C. Ajouter 15 mL d’HAuCl4 (1 mM) à la solution et remuer à 450 tr/min pendant 15 min. ajouter 120 µL de L (+)-acide ascorbique (64 mM), puis, immédiatement, mélanger à 1 200 tr/min pendant 30 s. ajouter 12 µL de graines Au et garder en remuant à 1 200 tr/min pendant 30 s. Incuber la solution dans un bain d’eau à 30 ° C pendant 18 heures. Ne pas déranger la solution et utiliser un bouchon pour refermer le flacon. Transférer la solution qui en résulte dans les tubes à centrifuger et centrifuger à 9 500 x g pendant 12 min à 20 ° C. Jeter le surnageant, disperse le culot dans 20 mL d’eau ultrapure et effectuer une étape de centrifugation plus. Disperse le granule final dans 3 mL d’eau distillée. Estimation de la concentration d’un mesurage de l’absorption UV-visible à l’aide du coefficient d’extinction pour la résonance de plasmon longitudinale AuNRs. Le coefficient d’extinction peut être prédite à l’aide de paramètres AuNR forme41. Stocker le AuNRs à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. 5. la fonctionnalisation des nanotiges en or avec l’ADN monocaténaire Remarque : Cette section décrit le protocole pour la fonctionnalisation AuNR avec l’ADN simple brin (ssDNA), suivant la route dite faible pH adaptée du précédent littérature42. Les AuNRs recouverts d’ADN sont purifiés par centrifugation ; Alternativement, la purification peut être effectuée à l’aide de gel d’agarose. Incuber 20 µL de brins d’ADN-thiol fonctionnalisées Lamb (1 mM) avec 20 µL de fraîchement préparés tris(2-carboxyethyl) chlorhydrate de phosphine (TCEP, 14 mM) pendant 1 h afin de réduire les ponts disulfures.NOTE : La forme de groupes thiol liaisons avec AuNRs, et la séquence de Lamb s’hybride avec la poignée de10 polyA sur l’origami, dans lequel trop ou trop peu de paires de base peut conduire à un dysfonctionnement ou un assembly instable.Attention : PTCE peut causer des brûlures graves de la peau et des lésions oculaires. Porter des gants de protection/protection vêtements/protection/visage lunettes. Mix 150 µL de AuNRs (10 nM) et 40 µL de thiol-ADN PTCE-traitée (0,5 mM). Ajouter 1 % dodécylsulfate de sodium (SDS) à la solution AuNR pour atteindre une concentration finale de SDS de 0,05 %. Ajuster le pH à 2,5-3 ~ 1 µl de HCl (1 M). Incuber pendant 2 h et en agitant à 70 tr/min.NOTE : Le rapport AuNR-à-ADN devrait être l’ordre de 1:5, 000-15 000, selon la taille des tiges. Pour les AuNRs (70 nm x 30 nm) préparé suivant le protocole décrit à l’article 4, un 13 000 excès de thiol-ADN est recommandé. Ajouter NaCl pour parvenir à une concertation finale de NaCl de 0,5 M et incuber pendant 4 heures à température ambiante en agitant à 70 tr/min.Remarque : Un changement de couleur à cette étape peut indiquer une fonctionnalisation d’ADN ayant échouée. Ajuster le pH à ~8.5 avec tampon TBE (10 x) et incuber pendant la nuit. Laver l’ADN-AuNRs 4 x en mélangeant les échantillons avec 1 mL de tampon de lavage (0,5 x TBE avec SDS 0,1 %) et centrifuger à 7 000 x g pendant 30 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension l’ADN-AuNRs dans le liquide restant (~ 40 µL). Estimation de la concentration d’ADN-AuNRs d’un mesurage de l’absorption UV-VIS comme indiqué au point 4.4.5.Remarque : La solution peut devenir légèrement « trouble » à pas 5.3 et 5.4 en raison du remplacement de CTAB de la surface de la AuNRs de thiol-ADN. La solution devienne claire sur le réchauffement de la planète jusqu’à environ 35 ° C pendant 5 min. 6. montage des nanotiges en or sur les modèles d’origami ADN Ajouter MgCl2 à la solution d’ADN purifié-AuNRs, à une concentration finale de 10 mM. Mélanger l’ADN-AuNRs purifiée et les origami d’un ratio de 10:1.NOTE : Un rapport plus faible peut diminuer le rendement de produit43. Recuire le mélange dans un mixeur avec un contrôle de la température de 40 ° C à 20 ° C en agitant à 400 tr/min, la procédure décrite dans le tableau 2.Remarque : Pour la caractérisation de la CD, l’échantillon peut être mesuré après cette étape sans plus de purification. Électrophorèse sur gel d’agarose de 0,7 % (3,5 h à 80 V) permet de purifier les structures de l’origami-AuNR final. Utilisez un transilluminateur blanc léger pour l’imagerie. Couper la bande produit (origami-AuNR dimère) (Figure 3), briser le gel sur une parafilm et extraire le liquide. Pipette de liquide dans une unité de filtration centrifuge et un essorage à 3 000 x g pendant 5 min. remettre en suspension l’origami-AuNRs dans la solution. Le rendement de récupération du gel est d’environ 50 %. Estimation de la concentration des structures origami-AuNR d’un mesurage de l’absorption UV-VIS comme indiqué au point 4.4.5. 7. imagerie de microscopie électronique de transmission Remarque : Cette formiate d’uranyle (UFo) souillant le protocole est adapté du précédent littérature44. Mix 200 µL de solution d’OVNI (0,75 %) et 1 µL de NaOH (5 M) et vortex immédiatement pour 2-3 min. centrifuger la solution tache pendant 3-4 min à 14 000 x g. Protéger la tache de l’exposition à la lumière (par exemple, en l’enveloppant dans du papier d’aluminium).Attention : UFo est toxique si inhalé ou avalé et peut causer une irritation des yeux. Dans le cas d’une exposition brève ou peu polluants, utiliser un dispositif de filtration respiratoire. En cas d’exposition intensive ou plue, utiliser un appareil de protection respiratoire autonome. Porter des gants. Le matériau des gants doit être imperméable et résistant aux OVNI et ses solutions. Porter des lunettes très hermétiques. Décharge luminescente carbone/formvar-enduit des grilles TEM pour 6 s juste avant utilisation pour augmenter hydrophilicité et promouvoir l’égorgement des structures. Pipetter 5 µL échantillon gouttes sur la grille TEM, incuber pendant 5-8 min et enlever la goutte en appuyant doucement sur un papier filtre avec le bord de la grille. Pipetter un grand (~ 20 µL) et une petite (~ 10 µL) goutte de la solution de tache sur un parafilm. Mettre la grille sur la goutte de solution de petite tache et séchez immédiatement en touchant le papier filtre avec le bord de la grille. Ensuite, mettez-le sur la goutte de solution de grosse tache pendant 30 s. Retirer le liquide sur la grille en touchant le papier filtre avec le bord de la grille. Placer la grille dans le porte-grille. Attendez que la grille à sécher pendant au moins 10 min. Caractériser les échantillons d’origami-AuNRs (Figure 6) par TEM origami (Figure 4) et AuNRs (Figure 5). 8. mesure de dichroïsme circulaire Purger le spectromètre CD avec N2 pendant 20 min.Remarque : La plupart des spectromètres CD requièrent purge avec N2 avant l’allumage de la lampe. Vérifiez le manuel du spectromètre CD. Définir la bande passante, plage de balayage et étape de l’acquisition.NOTE : La plage de balayage dépend des propriétés optiques de AuNRs, qui dépendent de la taille de la AuNRs. Mesure le CD vierge avec un tampon. Mesurer les spectres CD d’origami-AuNR échantillons (Figure 7).Remarque : Utilisez pintes ou cuvettes de verre pour la mesure de la CD. Cuvettes en plastique ne conviennent pas pour la spectroscopie de CD. Aussi, la plupart des spectromètres de CD permettent l’acquisition simultanée de l’absorption et CD de données.