DNA 折り紙テンプレートを用いたカイラル プラズモニック Metamolecules に金ナノロッドのアセンブリ

1. DNA 折り紙の設計 AuNRs の目的の相対的な空間配置と DNA 折り紙テンプレート (図 1A) の最適形状を識別します。AuNRs と折り紙テンプレートの構造パラメーターを推定します。さらに修正 (図 1B) を必要なステープルのおおよその位置を検索します。 ダウンロードし、インストール caDNAno18 DNA 折り紙テンプレートをデザインします。CaDNAno でテンプレートを任意の形状によると足場と主食の鎖、 Seq ツールをクリックして短鎖シーケンスを生成します。ペイント ツールをクリックし、さらに変更 (図 1C) を必要とする短鎖をマークします。 定番の DNA シーケンス (図 1C) を .csv ファイルにエクスポートするのにはエクスポート ツールをクリックします。 2 つの折り紙バンドルの間、角度Θを修正する二本鎖ロックを設計します。2 つのバンドルの相対的な回転方向に応じて折り紙構造は、左- または -右利き (LH ・ RH) キラル空間構成 (図 1B) を調整できます。 ステープルの .csv ファイルをスプレッドシート アプリケーションにインポートします。AuNR アセンブリ (ハンドル) に使用されるステープルの終わりにポリア10シーケンスを追加します。ロック シーケンスを持つ設計されていたロック サイトで定番のストランドを変更します。注: 代表的な結果のアセンブリに含まれてハンドル短鎖の 3′ 末端を突き出し、2 つの均等に分散、各の DNA 折り紙バンドルで 18 平行ヘリックスすべて 21 36 nt。最初と最後のハンドル位置の間の距離は 168 nt、約 57 nm (添付されている caDNAno ファイルを参照してください)。 2. DNA 折り紙テンプレートのアセンブリ 濃度正規化定番オリゴヌクレオチド (例, 100 μ M) の同量を混合することによって、ハンドルやロック、ストランドを含むステープル繊維 (SM) の作業在庫を準備します。注: 折り紙構造物通常主食ストランドの数百を含みます。ステープルは通常 (例えば、96 ウェル) 汚損で DNA のオリゴヌクレオチドの合成に特化したベンダーから購入したプレート。 500 μ L の 10 nM の折り紙のミックス トリス-EDTA (TE, 10 x)、MgCl2 (100 mM) の 100 μ L、塩化ナトリウム (100 mM)、H2O、100 μ L の SM の 175 μ L を 25 μ l 添加の 50 μ L (0.5 μ M)、ロックの繊維 (5 μ M) の 5 μ L、、50 μ L の足場 (100 nM)。 表 1に示すように 80 ° C から 20 ° C のたちの混合物をアニールします。 3. DNA 折り紙浄化 注: このセクションでは、agarose のゲルの浄化のためのプロトコルについて説明します。DNA 折り紙テンプレートは、代替的なアプローチ38,39を使用しても浄化することができます。 1% ゲルの Tris ホウ酸 EDTA の 100 mL の寒天 1 g を溶解 (TBE、0.5 x) 電子レンジで混合物を熱することによって。DNA 染色染色仕様に従って 10,000 x の 10 μ L を追加します。抽出手順 (手順 3.6) の紫外線への露出を最小限に抑える、青色励起下で視覚化することができます DNA 染色を使用します。 およそ 40 ° C にソリューションを冷却し、ゆっくりと振りながら MgCl2 (1.3 M) の 1 つの mL を追加します。ゲルをキャストし、室温で 30 分間インキュベートします。 電気泳動装置を設定し、風邪 (4 ° C) 連続したバッファーを注ぐ (0.5 11 mm MgCl2x TBE) ゲルのボックスに。氷の水のお風呂にジェル ボックスを配置します。 (6 x 読み込みバッファーを含む 15% polysucrose 400 と 0.25% ブロモフェノールの青水) 折り紙サンプルに読み込みバッファーを追加します。櫛の使用 (例, 50 μ L 厚さ 1.5 mm の 8 も櫛の) に従って適切なボリュームと井戸にサンプルをロードします。 80 V で 2 h の電気泳動を実行します。注: 折り紙を特徴付けるして開閉構造を分離するには、代わりに 1% 2% ゲルを使用、4 h 走行時間を延長します。 ゲル イメージャ (図 2) とゲルをイメージします。青い光 transilluminator を使用して、バンドの視覚化、折り紙バンドをカット、パラフィルムでゲルを粉砕、液体を抽出します。回復量は約 40% です。 遠心フィルター ユニットに液体をピペットし、スピン 3,000 x gで 5 分間で 260 で折り紙溶液の吸収を測定 (UV VI) の紫外・可視分光装置を用いた nm。1.3 108 M-1·cm-1倍の吸光係数を使用して折り紙の濃度を推定します。注: 折り紙ソリューション agarose のゲルの浄化後の典型的な濃度は、1-2 nM です。 後で使用のための 4 ° C で精製された折り紙テンプレートを格納します。 4. 金ナノロッドの合成 注: AuNR 合成のためのプロトコルは、変更を加える前の文学40から適応されます。 王水 5 分ですべてのガラス製品を洗浄、水ですすぎ、超純水、超音波、使用する前に乾燥します。 準備の 0.2 M 臭化ヘキサデシルトリメチル アンモニウム (CTAB) 1 mM HAuCl4アグノ3、4 mM 64 mM L (+)-アスコルビン酸と 6 mM NaBH4。NaBH4を溶解し、4 ° C で、冷蔵庫で保管使用して冷たい水 (4 ° C)アスコルビン酸は、新たに作成されます。注意: CTAB は吸入、摂取、アイコン タクト (刺激性) (刺激性) 皮膚に接触した場合危険です。適切な防護服を着用します。換気が不十分の場合に、防毒装備を着用します。NaBH4は (刺激性) 皮膚への接触やアイコン タクト (刺激)、摂取、吸入の場合非常に危険です。スプラッシュ ゴーグル、実験用の上着や手袋、水蒸気や塵マスクを着用します。必ず承認認定人工呼吸器または同等品を使用してください。 Au の種子を準備します。 ガラスの瓶に CTAB (0.2 M)、250 μ L の純水と HAuCl4 (1 mM) の 250 μ L の 500 μ L を追加します。450 rpm 5 分間室温で攪拌します。 1,200 rpm 撹拌速度を増加します。冷たい NaBH4ソリューション (6 mM、4 ° C) の 100 μ L を追加します。2 分後、攪拌を停止し、使用前に 30 分の 30 ° c の水浴のソリューションを孵化させなさい。 AuNRs を準備します。 丸底フラスコで 0.55 g CTAB と暖かい水 (60-65 ° C) の 15 mL の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸 0.037 g を溶解します。クールダウン 30 ° C への解決策をアグノ3 (4 mM)、600 μ L を追加し、2 分間 450 rpm でかき混ぜます。その後、操作を行わないでソリューション 15 分 30 ° C で ソリューションに HAuCl4 (1 mM) の 15 の mL を追加し、15 分追加 120 μ L (+) の 450 rpm でかき混ぜる-アスコルビン酸 (64 mM) と、すぐに、Au の種の 30 s. 追加 12 μ L の 1,200 rpm で攪拌し、30 での 1,200 rpm で攪拌し続ける s。 18 h の 30 ° c の水浴のソリューションを孵化させなさい。ソリューションの邪魔がなく、フラスコを閉じるにキャップを使用します。 遠沈管と 20 ° C で 12 分 9,500 × gで遠心分離に得られた溶液を移します。上澄みを廃棄、純水、20 mL にペレットを分散し、一歩遠心分離を行います。 3 mL の蒸留水で最終的なペレットを分散させます。縦方向のプラズモン共鳴の消散係数を用いた紫外可視吸収測定から AuNRs の濃度を推定します。消散係数は、AuNR 形状パラメーター41を使用して予測できます。それ以上の使用のための 4 ° C で AuNRs を格納します。 5. 一本鎖 DNA と金ナノロッドの機能化 注: 以前の文学42から適応いわゆる低 pH ルート一本鎖 DNA (ssDNA) と AuNR を高機能化プロトコルを説明します。DNA で覆われて AuNRs の精製遠心分離; しています。また、浄化は agarose のゲルの電気泳動を使用して実行できます。 作りたての 20 μ L で 20 μ L の polyT のチオール修飾 dna (1 mM) を孵化させなさい tris(2-carboxyethyl) ホスフィン塩酸塩 (TCEP、14 mM) ジスルフィド結合を減らすために 1 時間。注: チオール グループ フォーム社債 AuNRs と polyT シーケンスが多すぎるか少なすぎるの塩基対が、故障や不安定なアセンブリに導くかもしれない、折り紙のポリア10ハンドルと交配させます。注意: TCEP に重度の皮膚熱傷や目の損傷を引き起こす可能性が。保護手袋/保護服/眼保護面、保護を着用します。 AuNRs のミックス 150 μ L (10 nM) と TCEP 扱われるチオール DNA (0.5 mM) を 40 μ l 添加します。1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を最終的な SDS 濃度 0.05% に到達する AuNR ソリューションに追加します。塩酸 (1 M) ~ 1 μ L で 2.5-3 に pH を調整します。 70 rpm で揺れながら 2 時間インキュベートします。注: AuNR-DNA 比 1:5, 000-15,000、ロッドの大きさによって順序でする必要があります。AuNRs の (70 nm x 30 nm)、チオール DNA のセクション 4、過剰な 13,000 で説明されたプロトコルは推奨次の準備します。 塩化ナトリウム 0.5 M の最終的な塩化ナトリウム concertation に到達し、70 rpm で震えながら部屋の温度で 4 時間インキュベートを追加します。注: この手順で色の変更は可能性があります失敗した DNA の機能化を示します。 TBE バッファー (10 倍) と ~8.5 するために pH を調整し、一晩インキュベートします。 DNA AuNRs 4 を洗う洗浄液の 1 ml サンプルを混合することによって x (0.5 0.1 %sds の x TBE)、および 30 分の上澄みを除去し、残りの液体 (~ 40 μ L) で DNA AuNRs を再懸濁します 7,000 × gで遠心。4.4.5 の手順で説明するよう、紫外可視吸収測定による DNA AuNRs の濃度を推定します。注: ソリューションは CTAB 交換によるチオール DNA によって、AuNRs の表面から、5.3 5.4 ステップで少し ‘曇り’ になるかもしれない。ソリューションは 5 分 ~ 35 ° C までの温暖化はオフになります。 6. DNA 折り紙テンプレート金ナノロッドのアセンブリ MgCl2を 10 mM の最終濃度に精製 DNA-AuNRs のソリューションに追加します。精製 DNA AuNRs、10:1 の比率に折り紙を混ぜます。注: より低い比率は製品収量43を減らすかもしれない。 表 2の手順に従って 400 rpm で揺れながら 40 ° C から 20 ° C までの温度制御とミキサーで混合物をアニールします。注: CD 特性のサンプルはこの後さらに精製することがなく測定できます。 0.7% アガロースゲル電気泳動 (80 V で 3.5 h) を使用して、最終的な折り紙 AuNR 構造体を浄化します。 画像の白い光 transilluminator を使用します。製品バンド (折り紙 AuNR ダイマー) をカット (図 3)、パラフィルムでゲルを粉砕し、液体を抽出します。ピペット遠心ろ過ユニットとスピンで 3,000 x gで 5 分間に液体では、ソリューションの折り紙 AuNRs 再懸濁します。ゲルから回復利回りは約 50% です。 4.4.5 の手順で説明するよう紫外可視吸収測定から折り紙 AuNR 構造の濃度を推定します。 7. 透過電子顕微鏡イメージング 注: プロトコルを汚すこのウラニル ギ酸 (UFo) は、以前の文学44から適応。 UFo 溶液 (0.75%) のミックス 200 μ L水酸化ナトリウム (5 M) と 2-3 分のためにすぐに渦の 1 μ L 遠心 14,000 x gで 3-4 分間染色ソリューション。(例えば、アルミ箔に包んで) によって光を浴びるから汚れを保護します。注意: UFo は有毒吸入または飲み込んだし、眼への刺激を引き起こすことができます。簡単な露出や低公害の場合呼吸フィルター デバイスを使用します。集中的なまたは長い露出の場合自己完結型呼吸保護装置を使用します。手袋を着用します。手袋の素材は、不浸透性と UFo とそのソリューションに耐性をなければなりません。密閉ゴーグルを着用します。 グロー放電 6 の TEM グリッドを炭素/ホルムバール コーティングは親水性を高め、構造物の付着を促進するために使用前に、の s。ピペットの TEM グリッド 5 μ L サンプル滴、5-8 分間インキュベートし、グリッドの端にフィルター ペーパーに軽くさわりでドロップを削除します。 ピペットの大きい (~ 20 μ L) ・小 (〜 10 μ L) ドロップ、パラフィルム上汚れのソリューションの 1 つです。小さな汚れソリューション ドロップにグリッドを置いて、グリッドの端にフィルター ペーパーに触れることによってすぐに乾燥します。その後、大きな染色ソリューション ドロップ 30 の上に置く s。 グリッドの端にろ紙を触れることにより、グリッドに液体を削除します。グリッド ホルダーにグリッドを配置します。グリッドに少なくとも 10 分間乾燥するを待ちます。 折り紙 (図 4)、AuNRs (図 5)、折り紙 AuNRs (図 6) を tem の試料を特徴付けます。 8. 円二色性測定 CD 分光光度計 20 分間 N2を削除します。注: CD スペクトロ メーターのほとんどは、N2ランプ点火する前に削除を要求します。CD 分光計のマニュアルを確認してください。 帯域幅、スキャン範囲、および取得ステップを設定します。注: スキャンの範囲は、AuNRs のサイズに依存する AuNRs の光学的性質に依存します。 測定バッファーを空の CD。 折り紙 AuNR サンプル (図 7) の CD スペクトルを測定します。注: CD 測定のクォートやガラスのキュベットを使用します。プラスチック キュヴェット、CD 分光法に適しています。また、ほとんどの CD スペクトロ メーターは吸収と CD データの同時取得を可能します。