Sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneuplodia

La scelta di embrioni vitali di buona qualità con numeri di copia cromosomica normale (euploide) per il trasferimento nella riproduzione assistita aiuta a migliorare gli esiti della gravidanza. Tradizionalmente, il sistema di classificazione morfologica ben consolidato è ampiamente utilizzato per la valutazione degli embrioni a causa della sua facile disponibilità e della natura non invasiva. Tuttavia, è stato dimostrato che la valutazione morfologica può fornire solo informazioni limitate sulla qualità dell’embrione¹ e sul potenziale di impianto². Una ragione fondamentale è la sua incapacità di valutare la composizione cromosomica degli embrioni.

L’aneuploidia cromosomica (numero di copie anomale di cromosomi) è una delle principali cause che portano all’arresto dello sviluppo embrionale, al fallimento dell’impianto o alla perdita della gravidanza. L’insorgenza di aneuploidia è stata ben documentata negli embrioni umani, che rappresentail 60%,70% negli embrioni in fase di scissione 3,⁴ e 50%-60% nelle blastocisti⁵. Questo, in una certa misura, ha contribuito al collo di bottiglia nel miglioramento del tasso di gravidanza del trattamento di fecondazione in vitro (IVF), che ha mantenuto a circa il 35%,40%^6,7. Pertanto, la selezione di embrioni euploidi per il trasferimento è creduta per essere utile per migliorare gli esiti della gravidanza. A tal fine, sono stati ulteriormente sviluppati test genetici preimpianto per l’aneuploidia (PGT-A) per studiare la vitalità degli embrioni utilizzando approcci genetici. Ci sono un numero crescente di studi controllati randomizzati e studi di coorte che supportano il ruolo cruciale di PGT-A. È stato dimostrato che l’applicazione di PGT-A riduce il tasso di aborto spontaneo e aumenta il tasso di gravidanza clinica e il tasso di impianto⁸, tasso di gravidanza in corso e tasso di natalità vivo⁹.

Storicamente, diversi metodi sono stati applicati in PGT-A, come la fluorescenza nell’ibridazione situ (FISH), l’ibridazione genomica comparativa (CGH), l’ibridazione genomica comparativa (CGH), la cGH di array e il polimorfismo a singolo nucleotide (SNP)-microarray. Studi precedenti hanno indicato che PGT-A per gli embrioni in fase di scissione di FISH produce risultati scarsamente coerenti con quelli ottenuti dallo screening cromosomico completo (CCS) delle blastocisti corrispondenti utilizzando 59273array-CGH o SNP-microarray59273¹⁰. Queste discrepanze possono essere attribuite al mosaicismo cromosomico, ai manufatti tecnici FISH o all’autocorrezione embrionale degli errori di segregazione cromosomica durante lo sviluppo¹¹. È stato ampiamente riconosciuto che l’utilizzo di biopsie del trophectoderm blastocistico (TE) per PGT-A basati su array come array-CGH o SNP-microarray è efficace per identificare lo squilibrio cromosomico negli embrioni^10,12. Recentemente, il sequenziamento di nuova generazione a cella singola (NGS) fornisce un approccio ad alta produttività ed economico per l’analisi genetica e ha dimostrato l’applicabilità clinica in PGT-A^13,14,15, che lo rendono un approccio promettente alternativa ai metodi attualmente disponibili.

Qui, presentiamo un metodo NGS basato su semiconduttori veloce, robusto e a basso costo per lo screening dell’aneuploidia negli embrioni umani. Il primo passo del flusso di lavoro è l’amplificazione dell’intero genoma (WGA) del campione di embrioni biopsied, utilizzando un kit WGA a cella singola, seguito dalla costruzione della libreria di sequenziamento e dal successivo sequenziamento sul sistema di sequenziamento dei semiconduttori.

Attraverso il rilevamento degli^ioni H che vengono rilasciati da ogni incorporazione di triplofosfato deossiribonucleoside durante la sintesi del filamento di DNA, il sistema trasferisce i segnali chimici (pH change) catturati dagli elementi semiconduttori ai dati digitali diretti , che vengono ulteriormente interpretati nelle informazioni sulla sequenza del DNA. Eliminando la necessità di costosi rilevamenti ottici e reazioni di sequenziamento complesse, questa semplice chimica di sequenziamento riduce il costo totale del reagente e riduce il tempo di esecuzione del sequenziamento in 2 o 4 ore¹⁶. Ancora più importante, in base alle specifiche delle prestazioni del produttore, la piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori può generare fino a 15 GB di dati di sequenziamento (dipende dalla qualità della libreria) per corsa, che è significativamente superiore rispetto ad alcuni degli altri sequencer producendo solo circa 3-4 GB di dati (con 2 x 75 bp di lunghezza di lettura)¹⁷. Nelle applicazioni cliniche di PGT-A, questa piattaforma può ottenere 24 campioni per chip generando fino a 80 milioni di letture¹⁷ e almeno un milione di letture univoche di ogni campione. La profondità di lettura può garantire che ogni campione abbia una copertura dell’intero genoma di 0,05x. I vantaggi di cui sopra di questa piattaforma lo rendono un metodo di screening ideale e quindi, facilitare le sue ampie applicazioni in PGT-A¹⁸.