רצפי מוליכים למחצה עבור השרשה בדיקה גנטית עבור אנאפלואידיה
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת רצף מוליכים למחצה עבור בדיקה גנטית מראש עבור השרשה (PGT-A) עם היתרונות של זמן טיפול קצר, עלות נמוכה, ותפוקה גבוהה.
Abstract
התפתחות כרומוזומלית, אחת הסיבות העיקריות המובילות למעצר הפיתוח העובריים, כשל השרשה, או אובדן הריון, הייתה מתועדת היטב בעוברים אנושיים. השרשה הגנטית בדיקות עבור אנאפלואידיה (pgt-A) הוא מבחן גנטי המשפר באופן משמעותי את תוצאות הרבייה על ידי זיהוי חריגות כרומוזומלית של עוברים. רצף הדור הבא (NGS) מספק גישה בתפוקה גבוהה וחסכונית עבור ניתוח גנטי הראו ישימות קלינית ב-PGT-A. כאן, אנו מציגים שיטה מהירה רצף מוליכים למחצה מבוססי-ngs המבוסס על הקרנת ההקרנה של אנאפלואידיה בעוברים. השלב הראשון של זרימת העבודה הוא הגברה שלמה של הגנום (WGA) של הדגימה של העובר ביופסיה, ואחריו בנייה של הספרייה ברצף, וברצף הבא של מערכת רצף המוליכים למחצה. בדרך כלל, עבור יישום PGT-A, 24 דגימות יכול להיות טעון ברצף על כל שבב מייצר 60-80 מיליון קריאות באורך לקרוא ממוצע של 150 זוגות בסיס. השיטה מספקת פרוטוקול מעודן לביצוע הגברה והעשרה של הספריה ברצף, מה שהופך את ה-PGT-A לגילוי, תפוקה גבוהה, חסכוני וחוסך זמן. זמן ריצה של ברצף זה מוליך למחצה הוא רק 2-4 שעות, קיצור זמן הטיפול מקבלת דגימות להנפיק דוחות לתוך 5 ימים. כל היתרונות הללו להפוך את הבקשה הזו לשיטה אידיאלית כדי לזהות aneuploidies כרומוזוממות מעוברים ובכך, להקל על יישום רחב שלה PGT-A.
Introduction
בחירת עוברים קיימא באיכות טובה עם מספרי עותק רגיל של כרומוזום (אאופואיד) להעברת בסיוע רבייה עוזר לשפר את תוצאות ההריון. באופן מסורתי, מערכת הדירוג מורפולוגית היטב משמשת רבות להערכת העובר בשל זמינותו הקלה והטבע הלא פולשני. עם זאת, זה הוכח כי הערכה מורפולוגית יכול רק לספק מידע מוגבל על איכות העובר1 ו השרשה פוטנציאל2. סיבה בסיסית אחת היא חוסר יכולתה להעריך את ההרכב הרומוזומאלי של העוברים.
כרומוזומלית כרומוזום (מספר עותק לא תקין של כרומוזומים) הוא אחד הגורמים העיקריים המובילים למעצר לפיתוח עובריים, כישלון השרשה או אובדן ההריון. התרחשות התוכנית הייתה מתועדת היטב בעוברים אנושיים, הנהלת חשבונות ב-60% ל-70% בעוברי-בשלב3,4 ו-50%-60% ב-blastocysts5. זה, במידה מסוימת, תרם לצוואר הבקבוק בשיפור שיעור ההריון של הפריה חוץ גופית (IVF) הטיפול, אשר החזיק בסביבות 35%-40%6,7. לכן, בחירת עוברי אאופואיד עבור העברה הוא האמין להועיל לשיפור תוצאות ההריון. לשם כך, השרשה מראש בדיקות גנטיות עבור אנאפלואידיה (pgt-A) פותחה עוד יותר כדי לחקור את הכדאיות העובר באמצעות גישות גנטיות. ישנם מספר גדל והולך של מבחנים אקראיים מבוקרים ומחקרים קוהורטים התומכים תפקיד מכריע של PGT-A. זה הוכח כי היישום של PGT-A מקטין את שיעור ההפלה ומגביר את שיעור ההריון הקליני שיעור8, שוטף שיעור ההריון ואת שיעור הלידה בחיים9.
מבחינה היסטורית, שיטות שונות הוחלו PGT-A, כגון זריחה באתרו היברידיזציה (דג), הכלאה גנומית השוואתי (CGH), מערך-CGH, ו בודד פולימורפיזם מיקרופיזם (SNP)-microarray. מחקרים קודמים הראו כי PGT-A עבור מחשוף-שלב העוברים על ידי דגים תשואות תוצאות כי הם עקביים בצורה גרועה עם אלה המתקבלים על ידי הקרנת כרומוזומלית מקיפה (סמ ק) של blastocysts המקביל באמצעות 59273array-CGH או . Microarray5927310 ניתן לייחס אי-התאמות אלה לפסיפס כרומוזום, לפריטים טכניים של דגים, או לתיקון עצמי מתחלקים בשגיאות הפרדה כרומוזומלית במהלך פיתוח11. זה הוכר באופן נרחב כי באמצעות בלסטוציסט trophectoderm עור (TE) ביופסיות עבור pgt מבוסס מערך-A כגון array-cgh או snp-microarray יעיל לזיהוי חוסר איזון כרומוזום בעוברים10,12. לאחרונה, רצף בודד של הדור הבא (ngs) מספק גישה בתפוקה גבוהה וחסכונית עבור ניתוח גנטי הראו ישימות קליני ב pgt-a13,14,15, מה שעושה את זה מ מבטיח חלופה לשיטות הזמינות כעת.
כאן, אנו מציגים מהיר, חסון, ובעלות נמוכה רצף מוליכים למחצה מבוססי-ngs שיטה להקרנה של אנאפלואידיה בעוברים אנושיים. השלב הראשון של זרימת העבודה הוא הגברה שלמה של הגנום (WGA) של הדגימה של העובר ביופסיה, שימוש בערכה של תא יחיד WGA, ואחריו בנייה של הספרייה ברצף, וברצף הבא של מערכת רצף המוליכים למחצה.
באמצעות גילוי ה-H+ יונים שפורסמו מכל התאגדות טריפוספט deאוקסיריוונאוסייד במהלך סינתזה הגדיל DNA, המערכת מעבירה את האותות הכימיים (pH שינוי) שנתפסו על ידי אלמנטים מוליכים למחצה להפנות נתונים דיגיטליים , אשר מפורשים עוד לתוך מידע רצף ה-DNA. ביטול הדרישה לזיהוי אופטי יקר ותגובות רצף מורכבות, זה כימיה פשוטה ברצף מפחית את העלות הכימית הכולל מקצר את רצף הזמן ריצה לתוך 2 עד 4 שעות16. חשוב מכך, בהתבסס על מפרטי הביצועים של היצרן, פלטפורמת רצף המוליכים למחצה יכולה ליצור עד 15 GB נתונים ברצף (תלוי באיכות הספריה) לפי הפעלה, שהיא גבוהה באופן משמעותי מכמה מהסקוונים האחרים בהפקת רק סביב 3-4 GB נתונים (עם 2 x 75 bp לקרוא אורך)17. ביישומים קליניים של PGT-A, פלטפורמה זו יכולה להשיג 24 דגימות לכל שבב לייצר עד 80,000,000 קורא17 לפחות 1,000,000 קריאות ייחודיות של כל מדגם. עומק הקריאה יכול להבטיח כי כל מדגם יש לפחות 0.05 x כיסוי הגנום כולו. היתרונות הנ ל של פלטפורמה זו להפוך אותו שיטת הקרנה אידיאלית וכך, להקל על היישומים הרחבים שלה ב-PGT-A18.
Protocol
Representative Results
Discussion
שונה מchemistries ברצף אחר, הרצף המתואר כאן משתמש מוליך למחצה לאיתור נוקלאוטידים. השבב עצמו הוא מכשיר אלקטרוני המזהה יוני מימן על ידי התאגדות בסיס מונחה פולימראז17, אשר מאפשר 2-4 הזמן רצף של תוכנית פרוטון. חוץ מזה, השבב הוא שבב המיקרוגל המאפשר לוקליזציה של מולקולה היעד אחד, אשר שונה הכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן למחקר כללי (Ref No. 14162417) מהונג קונג, הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (Ref No. 81860272), תוכנית המחקר העיקרית של המדע המחוזי הקרן טכנולוגיה של גואנגשי (שופט לא. AB16380219), ומענק הקרן הפוסט-דוקטורט של סין (Ref No. 2018M630993) מסין.
Materials
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi‑Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi‑Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi‑Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi‑Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
References
- Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
- Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
- Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
- Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
- Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).
- Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
- Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
- Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).
- Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
- Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
- Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).
- Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
- Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
- Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
- Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), 413-419 (2002).
- Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).
