Séquençage des semi-conducteurs pour les tests génétiques préimplantatoires pour l'anéuploidy
Summary
Ici, nous introduisons une méthode de séquençage des semi-conducteurs pour les tests génétiques préimplantatoires pour l’aneuploidy (PGT-A) avec les avantages d’un court délai d’exécution, à faible coût et d’un débit élevé.
Abstract
L’anéuploidy chromosomique, l’une des principales causes menant à l’arrêt embryonnaire de développement, à l’échec d’implantation, ou à la perte de grossesse, a été bien documenté dans les embryons humains. Le test génétique préimplantatoire pour l’aneuploidy (PGT-A) est un test génétique qui améliore considérablement les résultats reproducteurs en détectant les anomalies chromosomiques des embryons. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) fournit une approche à haut débit et rentable pour l’analyse génétique et a montré l’applicabilité clinique dans PGT-A. Ici, nous présentons une méthode NGS basée sur le séquençage des semi-conducteurs rapide et peu coûteux pour le dépistage de l’aneuploidy chez les embryons. La première étape du flux de travail est l’amplification du génome entier (WGA) du spécimen d’embryon biopsié, suivie de la construction de la bibliothèque de séquençage, et du séquençage ultérieur sur le système de séquençage des semi-conducteurs. En général, pour une application PGT-A, 24 échantillons peuvent être chargés et séquencés sur chaque puce générant 60 à 80 millions de lectures à une longueur moyenne de lecture de 150 paires de base. La méthode fournit un protocole raffiné pour effectuer l’amplification du modèle et l’enrichissement de la bibliothèque de séquençage, ce qui rend la détection PGT-A reproductible, à haut débit, rentable et économique. La durée de fonctionnement de ce séquenceur semi-conducteur n’est que de 2 à 4 heures, ce qui réduit le délai d’exécution entre la réception d’échantillons et la publication de rapports en 5 jours. Tous ces avantages font de cet analyse une méthode idéale pour détecter les anéuploidies chromosomiques à partir d’embryons et ainsi faciliter son application large dans pgT-A.
Introduction
Le choix d’embryons viables de bonne qualité avec des numéros de copie chromosomiques normaux (euploïdes) pour le transfert en procréation assistée aide à améliorer les résultats de la grossesse. Traditionnellement, le système de classement morphologique bien établi est largement utilisé pour l’évaluation des embryons en raison de sa disponibilité facile et de sa nature non invasive. Cependant, il a été démontré que l’évaluation morphologique ne peut fournir que des informations limitées sur la qualité de l’embryon1 et le potentiel d’implantation2. Une raison fondamentale est son incapacité à évaluer la composition chromosomique des embryons.
L’anéuploidy chromosomique (nombre anormal de copie des chromosomes) est l’une des principales causes menant à l’arrêt embryonnaire de développement, à l’échec d’implantation ou à la perte de grossesse. L’apparition de l’aneuploidy a été bien documentée dans les embryons humains, représentant 60%-70% dans les embryons de clivage-étape3,4 et 50% -60% dans les blastocystes5. Cela, dans une certaine mesure, a contribué au goulot d’étranglement dans l’amélioration du taux de grossesse du traitement de fécondation in vitro (FIV), qui s’est maintenu à environ 35%-40%6,7. Par conséquent, la sélection d’embryons euploïdes pour le transfert est considérée comme bénéfique pour améliorer les résultats de la grossesse. À cette fin, des tests génétiques préimplantatoires pour l’aneuploidy (PGT-A) ont été développés pour étudier la viabilité des embryons à l’aide d’approches génétiques. Il y a de plus en plus d’essais contrôlés randomisés et d’études de cohorte qui appuient le rôle crucial du TCP-A. Il a été prouvé que l’application de PGT-A diminue le taux de fausses couches et augmente le taux de grossesse clinique et le taux d’implantation8, le taux de grossesse continue et le taux de naissance satinaire9.
Historiquement, différentes méthodes ont été appliquées dans pgT-A, tels que l’hybridation in situ de fluorescence (FISH), l’hybridation génomique comparative (CGH), le tableau-CGH, et le polymorphisme nucléotide simple (SNP)-microarray. Des études antérieures ont indiqué que PGT-A pour les embryons de clivage-étape par FISH donne des résultats qui sont mal compatibles avec ceux obtenus par le dépistage chromosomique complet (CCS) des blastocystes correspondants en utilisant 59273array-CGH ou SNP-microarray5927310. Ces écarts peuvent être attribués au mosaïsme chromosomique, aux artefacts techniques FISH, ou à l’autocorrection embryonnaire des erreurs de ségrégation chromosomique s’est avérée au cours du développement11. Il a été largement reconnu que l’utilisation de biopsies trophectoderm blastocyste (TE) pour le tableau à base de PGT-A tels que tableau-CGH ou SNP-microarray est efficace pour identifier le déséquilibre chromosomique chez les embryons10,12. Récemment, le séquençage monocellulaire de prochaine génération (NGS) offre une approche à haut débit et rentable pour l’analyse génétique et a montré l’applicabilité clinique dans PGT-A13,14,15, qui en font un alternative prometteuse aux méthodes actuellement disponibles.
Ici, nous présentons une méthode NGS rapide, robuste et peu coûteuse basée sur le séquençage des semi-conducteurs pour le dépistage de l’aneuploidy chez les embryons humains. La première étape du flux de travail est l’amplification du génome entier (WGA) du spécimen d’embryon biopsié, à l’aide d’un kit WGA à cellule unique, suivie de la construction d’une bibliothèque de séquençage, et du séquençage ultérieur sur le système de séquençage des semi-conducteurs.
En détectant lesions H qui sont libérés de chaque incorporation de triphosphate de désoxyribonucleoside lors de la synthèse des brins d’ADN, le système transfère les signaux chimiques (changement de pH) capturés par les éléments semi-conducteurs pour diriger les données numériques , qui sont interprétés en autres mesures d’information sur la séquence d’ADN. Éliminant l’exigence de détection optique coûteuse et de réactions de séquençage complexes, cette simple chimie de séquençage réduit le coût total du réactif et réduit le temps de séquençage en 2 à 4 heures16. Plus important encore, sur la base des spécifications de performance du fabricant, la plate-forme de séquençage des semi-conducteurs peut générer jusqu’à 15 Go de données de séquençage (dépend de la qualité de la bibliothèque) par course, ce qui est significativement plus élevé que certains des autres séquenceurs ne produisant qu’environ 3 à 4 Go de données (avec 2 x 75 bp de longueur de lecture)17. Dans les applications cliniques de PGT-A, cette plate-forme peut atteindre 24 échantillons par puce générant jusqu’à 80 millions de lectures17 et au moins un million de lectures uniques de chaque échantillon. La profondeur de lecture peut garantir que chaque échantillon a au moins 0,05x couverture du génome entier. Les avantages ci-dessus de cette plate-forme en font une méthode de dépistage idéale et donc, faciliter ses larges applications dans PGT-A18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Différent des autres chimies de séquençage, le séquenceur décrit ici utilise des semi-conducteurs pour la détection des nucléotides. La puce elle-même est un dispositif électronique qui détecte les ions d’hydrogène par polymérase-conduite incorporation de base17, qui permet 2-4 h temps de séquençage du programme Proton. En outre, la puce est une puce de micropuits qui permet la localisation d’une molécule cible, qui est différente de la chimie de séquençage des cellules d’écoule…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le General Research Fund (Ref. 14162417) de Hong Kong, la National Natural Science Foundation of China (Réf. 81860272), le Plan de recherche majeur de la Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Réf. No. AB16380219), et la China Postdoctoral Science Foundation Grant (Ref No. 2018M630993) de Chine.
Materials
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi‑Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi‑Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi‑Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi‑Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
References
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