Secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía

La elección de embriones viables de buena calidad con números normales de copia cromosómica (euploide) para la transferencia en reproducción asistida ayuda a mejorar los resultados del embarazo. Tradicionalmente, el sistema de clasificación morfológica bien establecido es ampliamente utilizado para la evaluación de embriones debido a su fácil disponibilidad y naturaleza no invasiva. Sin embargo, se ha demostrado que la evaluación morfológica sólo puede proporcionar información limitada sobre la calidad del embrión¹ y el potencial de implantación^2. Una razón fundamental es su incapacidad para evaluar la composición cromosómica de los embriones.

La aneuploidía cromosómica (número anormal de cromosomas) es una de las principales causas que conducen a la detención del desarrollo embrionario, el fallo de implantación o la pérdida del embarazo. La aparición de aneuploidía ha sido bien documentada en embriones humanos, representando entre el 60% y el 70% en embriones en etapa de escisión^3,4 y 50%-60% en blastocistos⁵. Esto, en cierta medida, ha contribuido al cuello de botella en la mejora de la tasa de embarazo del tratamiento de fertilización in vitro (FIV), que se ha mantenido en torno al 35%-40%^6,7. Por lo tanto, se cree que la selección de embriones euploides para la transferencia es beneficioso para mejorar los resultados del embarazo. Con este fin, se han desarrollado más a fondo pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) para investigar la viabilidad de los embriones mediante enfoques genéticos. Cada vez hay más ensayos controlados aleatorios y estudios de cohortes que apoyan el papel crucial de la PGT-A. Se ha demostrado que la aplicación de PGT-A disminuye la tasa de abortoespontáneo y aumenta la tasa de embarazo clínico y la tasa de implantación 8, la tasa de embarazo en curso y la tasa de nacimientos vivos^9.

Históricamente, se han aplicado diferentes métodos en PGT-A, como la hibridación in situ por fluorescencia (FISH), la hibridación genómica comparativa (CGH), la matriz-CGH y el polimorfismo nucleótido único (SNP)-microarray. Estudios anteriores han indicado que PGT-A para embriones en etapa de escisión por FISH produce resultados que son poco consistentes con los obtenidos por cribado cromosómico integral (CCS) de los blastocistos correspondientes utilizando 59273array-CGH o SNP-microarray59273¹⁰. Estas discrepancias pueden atribuirse al mosaico cromosómico, a los artefactos técnicos FISH o a la autocorrección embrionaria de los errores de segregación cromosómica durante el desarrollo¹¹. Se ha reconocido ampliamente que el uso de biopsias de tropoctodem (TE) de blastoctodermo (TE) para PGT-A basado en matrices, como la matriz-CGH o el microarray SNP, es eficaz para identificar el desequilibrio cromosómico en embriones^10,12. Recientemente, la secuenciación de próxima generación de una sola célula (NGS) proporciona un enfoque de alto rendimiento y rentable para el análisis genético y ha demostrado aplicabilidad clínica en PGT-A^13,14,15, lo que la convierte en un alternativa prometedora a los métodos actualmente disponibles.

Aquí, presentamos un método NGS basado en secuenciación de semiconductores rápido, robusto y de bajo costo para el cribado de la aneuploidía en embriones humanos. El primer paso del flujo de trabajo es la amplificación del genoma completo (WGA) de la muestra de embrión biopsiado, utilizando un kit WGA de una sola célula, seguido de la construcción de la biblioteca de secuenciación, y la secuenciación posterior en el sistema de secuenciación de semiconductores.

Mediante la detección de los iones H⁺ que se liberan de cada incorporación de trifosfato de desoxirribonucleósido durante la síntesis de la cadena de ADN, el sistema transfiere las señales químicas (cambio de pH) capturadas por los elementos semiconductores a datos digitales directos , que se interpretan más detalladamente en la información de la secuencia de ADN. Eliminando el requisito de detección óptica costosa y reacciones de secuenciación complejas, esta química de secuenciación simple reduce el costo total del reactivo y acorta el tiempo de funcionamiento de la secuenciación en 2 x 4 horas^16. Más importante aún, sobre la base de las especificaciones de rendimiento del fabricante, la plataforma de secuenciación de semiconductores puede generar hasta 15 GB de datos de secuenciación (depende de la calidad de la biblioteca) por carrera, que es significativamente mayor que algunos de los otros secuenciadores produciendo sólo alrededor de 3 x 4 GB de datos (con 2 x 75 bp de longitud de lectura)¹⁷. En las aplicaciones clínicas de PGT-A, esta plataforma puede lograr 24 muestras por chip generando hasta 80 millones de lecturas¹⁷ y al menos un millón de lecturas únicas de cada muestra. La profundidad de lectura puede garantizar que cada muestra tenga al menos una cobertura completa del genoma de 0,05 x. Las ventajas anteriores de esta plataforma la convierten en un método de cribado ideal y, por lo tanto, facilitan sus amplias aplicaciones en PGT-A^18.