Halfgeleider sequencing voor pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie

Het kiezen van levensvatbare embryo’s van goede kwaliteit met normale chromosoom kopie nummers (euploïde) voor overdracht in geassisteerde reproductie helpt de zwangerschapsuitkomsten te verbeteren. Traditioneel wordt het gevestigde morfologische beoordelingssysteem op grote schaal gebruikt voor de evaluatie van embryo’s vanwege de gemakkelijke beschikbaarheid en de niet-invasieve aard. Er is echter aangetoond dat morfologische beoordeling slechts beperkte informatie kan verschaffen over embryo kwaliteit¹ en implantatie potentiaal². Een fundamentele reden is het onvermogen om de chromosomale samenstelling van de embryo’s te evalueren.

Chromosomale aneuploïdie (abnormaal kopie aantal chromosomen) is een van de belangrijkste oorzaken die tot embryonale ontwikkeling aanhouding, implantatie falen of zwangerschaps verlies leidt. Het optreden van aneuploïdie is goed gedocumenteerd in menselijke embryo’s, waarbij 60% − 70% is opgenomen in het splijting-stadium embryo’s^3,4 en 50% − 60% in blastocysten⁵. Dit heeft tot op zekere hoogte bijgedragen tot het knelpunt bij het verbeteren van het zwangerschaps percentage van de behandeling in vitro fertilisatie (IVF), dat ongeveer 35% − 40%^6,7heeft gehandhaafd. Daarom, het selecteren van euploïde embryo’s voor overdracht wordt verondersteld te zijn gunstig voor het verbeteren van de resultaten van de zwangerschap. Hiertoe is een pre-implantatie genetische test voor aneuploïdie (PGT-A) verder ontwikkeld om de leefbaarheid van embryo’s te onderzoeken aan de hand van genetische benaderingen. Er zijn toenemende aantallen gerandomiseerde gecontroleerde studies en cohort studies die de cruciale rol van PGT-A ondersteunen. Het is bewezen dat de toepassing van PGT-A vermindert de miskraam tarief en verhoogt de klinische zwangerschap tarief en implantatie tarief⁸, lopende zwangerschaps tarief en live geboortecijfer⁹.

Historisch gezien zijn er verschillende methoden toegepast in PGT-A, zoals fluorescentie in situ-hybridisatie (vissen), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH), array-CGH en single nucleotide polymorfisme (SNP)-Microarray. Uit eerdere studies is gebleken dat PGT-A voor de splijter fase van embryo’s door vissen resultaten oplevert die slecht consistent zijn met die welke zijn verkregen door uitgebreide chromosomale screening (CCS) van overeenkomstige blastocysten met 59273array-cgh of SNP-microarray59273¹⁰. Deze verschillen kunnen worden toegeschreven aan chromosomale mosaïsme, vis technische artefacten, of embryonale zelf correctie van chromosoomsegregatie fouten tijdens de ontwikkeling¹¹. Het is alom erkend dat het gebruik van blastocyst trophectoderm (te) biopsieën voor array-gebaseerde PGT-A zoals array-cgh of SNP-Microarray effectief is voor het identificeren van de chromosomale onbalans in embryo’s^10,12. Onlangs biedt single-cell sequentiëren van de volgende generatie (NGS) een hoge doorvoer en een kosteneffectieve aanpak voor genetische analyse en heeft het klinische toepasbaarheid aangetoond in PGT-a^13,14,15, waardoor het een veelbelovend alternatief voor de momenteel beschikbare methoden.

Hier presenteren we een snelle, robuuste en goedkope NGS-methode op basis van halfgeleider-sequencing voor het screenen van aneuploïdie in menselijke embryo’s. De eerste stap van de workflow is Whole genoom Amplification (WGA) van het biopsied embryo specimen, met behulp van een WGA Kit met één cel, gevolgd door de bouw van sequentiëren bibliotheek, en opeenvolgende sequentiëren op het halfgeleider volgorde systeem.

Door het detecteren van de H⁺ -ionen die vrijkomen uit elke deoxyribonucleoside trifosfaat opname tijdens de DNA-strand synthese, draagt het systeem de chemische signalen (pH-verandering) over die door de halfgeleiderelementen worden opgevangen naar directe digitale gegevens , die verder worden geïnterpreteerd in DNA sequentie-informatie. Het elimineren van de eis voor dure optische detectie en complexe sequentie reacties, deze eenvoudige sequentie chemie vermindert de totale reagens kosten en verkort de sequentiëren looptijd in 2 − 4 uur¹⁶. Wat nog belangrijker is, op basis van de prestatiespecificaties van de fabrikant, kan het platform voor het sequentiëren van halfgeleider tot 15 GB aan sequentiegegevens genereren (afhankelijk van de kwaliteit van de bibliotheek) per run, wat aanzienlijk hoger is dan sommige van de andere sequencers produceren slechts ongeveer 3 − 4 GB gegevens (met 2 x 75 BP Lees lengte)¹⁷. In klinische toepassingen van PGT-A, dit platform kan bereiken 24 monsters per chip genereren tot 80.000.000 leest¹⁷ en ten minste 1.000.000 unieke leest van elk monster. De Lees diepte kan ervoor zorgen dat elk monster ten minste 0,05 x hele genoom dekking heeft. De bovenstaande voordelen van dit platform maken het een ideale screeningsmethode en faciliteren zo de brede toepassingen in PGT-A¹⁸.