Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie

Die Wahl von qualitativ hochwertigen lebensfähigen Embryonen mit normalen Chromosomenkopiennummern (Euploid) für den Transfer in der assistierten Reproduktion trägt zur Verbesserung der Schwangerschaftsergebnisse bei. Traditionell wird das etablierte morphologische Sortiersystem aufgrund seiner einfachen Verfügbarkeit und nicht-invasiven Natur häufig für die Embryonenbewertung verwendet. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die morphologische Bewertung nur begrenzte Informationen über embryonale Qualität¹ und Implantationspotenzial²liefern kann. Ein wesentlicher Grund ist seine Unfähigkeit, die Chromosomenzusammensetzung der Embryonen zu bewerten.

Chromosomale Aneuploidie (abnorme Kopieanzahl von Chromosomen) ist eine der Hauptursachen, die zu embryonalen Entwicklungsstillstand, Implantationsversagen oder Schwangerschaftsverlust führen. Das Auftreten von Aneuploidie ist in menschlichen Embryonen gut dokumentiert, was 60 % bis 70 % bei Spalt-Embryonen^3,4 und 50 % 60 % in Blastozysten⁵ausmacht. Dies hat in gewissem Maße zu dem Engpass bei der Verbesserung der Schwangerschaftsrate der In-vitro-Fertilisation (IVF) beigetragen, die bei etwa 35% bis 40%^6,7gehalten wurde. Daher wird angenommen, dass die Auswahl von euploiden Embryonen für die Übertragung vorteilhaft für die Verbesserung der Schwangerschaftsergebnisse ist. Zu diesem Zweck wurden die genetischen Präimplantationstests für aneuploidierend (PGT-A) weiterentwickelt, um die Lebensfähigkeit von Embryonen mit genetischen Ansätzen zu untersuchen. Es gibt eine steigende Anzahl von randomisierten kontrollierten Studien und Kohortenstudien, die die entscheidende Rolle von PGT-A unterstützen. Es wurde nachgewiesen, dass die Anwendung von PGT-A die Fehlgeburtsrate senkt und die klinische Schwangerschaftsrate und Implantationsrate⁸, laufende Schwangerschaftsrate und Lebendgeburtsrate⁹erhöht.

Historisch gesehen wurden verschiedene Methoden in PGT-A angewendet, wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), Array-CGH und Single Nukleotide Polymorphism (SNP)-Mikroarray. Frühere Studien haben gezeigt, dass PGT-A für Embryos im Spaltstadium von FISH Ergebnisse liefert, die schlecht mit denen übereinstimmen, die durch umfassendes chromosomales Screening (CCS) entsprechender Blastozysten mit 59273Array-CGH oder SNP-Mikroarray59273¹⁰. Diese Diskrepanzen können auf chromosomalen Mosaikismus, technische FISCH-Artefakte oder embryonale Selbstkorrektur von Chromosomensegregationsfehlern während der Entwicklung¹¹zurückgeführt werden. Es ist weithin anerkannt, dass die Verwendung von Blastozysten-Trophektomie (TE)-Biopsien für Array-basierte PGT-A wie Array-CGH oder SNP-Mikroarray wirksam ist, um das chromosomale Ungleichgewicht in Embryonen^10,12zu identifizieren. Kürzlich bietet die single-cellnext-generation Sequencing (NGS) einen hochdurchsatz- und kostengünstigen Ansatz für die genetische Analyse und hat die klinische Anwendbarkeit in PGT-A^13,14,15gezeigt, die es zu einem vielversprechende Alternative zu den derzeit verfügbaren Methoden.

Hier präsentieren wir eine schnelle, robuste und kostengünstige, auf Halbleitersequenzierung basierende NGS-Methode zum Screening von Aneuploidie nder menschlichen Embryonen. Der erste Schritt des Workflows ist die gesamte Genomverstärkung (WGA) der biopsied embryonalen Probe, mit einem einzelligen WGA-Kit, gefolgt von der Erstellung einer Sequenzierungsbibliothek und anschließender Sequenzierung des Halbleitersequenzierungssystems.

Durch die Detektion der H⁺ Ionen, die bei jeder Desoxyribonukleosidtriphosphat-Inkorporation während der DNA-Strangsynthese freigesetzt werden, überträgt das System die von den Halbleiterelementen erfassten chemischen Signale (pH-Änderung), um digitale Daten zu leiten. , die weiter in DNA-Sequenzinformationen interpretiert werden. Diese einfache Sequenzierungschemie entfällt die Anforderung an teure optische Detektion und komplexe Sequenzierungsreaktionen und reduziert die Gesamtkosten der Reagenzien insgesamt und verkürzt die Sequenzierungslaufzeit auf 2 bis 4 Stunden¹⁶. Noch wichtiger ist, dass die Halbleitersequenzierungsplattform auf der Grundlage der Leistungsspezifikationen des Herstellers bis zu 15 GB Sequenzierungsdaten (abhängig von der Qualität der Bibliothek) pro Durchlauf generieren kann, was deutlich höher ist als bei einigen anderen Sequenzern. nur etwa 3 x 4 GB Daten (mit 2 x 75 bp Leselänge)¹⁷. In klinischen Anwendungen von PGT-A kann diese Plattform 24 Proben pro Chip erreichen, der bis zu 80 Millionen Lesevorgänge¹⁷ und mindestens eine Million einzigartige Lesevorgänge jeder Probe generiert. Die Lesetiefe kann sicherstellen, dass jede Probe mindestens 0,05x gesamte Genomabdeckung hat. Die oben genannten Vorteile dieser Plattform machen sie zu einem idealen Screening-Verfahren und erleichtern so ihre breiten Anwendungen in PGT-A¹⁸.