Summary

Un modelo de administración Oral de Galleria mellonella para la respuesta inmune innata Study Commensal-Induced

Published: March 21, 2019
doi:

Summary

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para un modelo de administración oral con larvas de Galleria mellonella y cómo caracterizar inducido la respuesta inmune innata. Mediante este protocolo, investigadores sin experiencia práctica será capaces de usar la g. mellonella forzada método.

Abstract

La investigación del potencial inmunogénico de bacterias comensales en el sistema inmune de host es un componente esencial al estudiar las interacciones huésped-microbio intestinal. Está bien establecido que diversos comensales exhiben un potencial diferente para estimular el sistema inmune intestinal del host. Estas investigaciones involucran animales vertebrados, especialmente roedores. Puesto que cada vez más preocupaciones éticas están relacionadas con experimentos con vertebrados, hay una alta demanda para los modelos invertebrados reemplazos.

Aquí, ofrecemos un modelo de la administración oral de Galleria mellonella con bacterias no patógenas comensales y la posible evaluación del potencial inmunogénico de comensales en el sistema inmunológico de g. mellonella . Demostrar que g. mellonella es un modelo de reemplazo invertebrados alternativa útil que permite el análisis de comensales con diferente potencial inmunogénico como Bacteroides vulgatus y Escherichia coli. Curiosamente, las bacterias no exhiben ningún efecto de matar a las larvas, que es similar a los mamíferos. Las respuestas inmunes de g. mellonella eran comparables con vertebrados la respuesta inmune innata e implican el reconocimiento de las bacterias y la producción de moléculas antimicrobianas. Proponemos que g. mellonella fue capaz de restablecer el anterior equilibrio de la microbiota, que es bien conocido de individuos mamíferos sanos. Aunque proporcionando comparable respuesta inmune innata en g. mellonella y vertebrados, g. mellonella no albergan un sistema inmune adaptante. Puesto que los componentes investigados del sistema inmune innato son evolutivos conservado, el modelo permite un preselección y primer análisis de propiedades inmunogénicas bacterianas.

Introduction

El microbioma intestinal es un componente esencial para el mantenimiento de la homeostasis e involucra tanto las respuestas inmunes innata y adaptativa1,2. La comunidad de la microbiota comensal se caracteriza por diferentes componentes comensales: simbiontes que confieren efectos beneficiosos por funciones inmunomoduladoras importantes y pathobionts que puede tener efectos perjudiciales genéticamente predispuestos acoge y promover y provocar inflamación intestinal3,4. Muchos estudios de simbiontes y pathobionts y su influencia en el sistema de inmune del anfitrión han sido publicados principalmente estudio de respuestas inmunes adaptativas.

Puesto que estos estudios implican muchos animales para las investigaciones y la protección y reemplazo de los animales utilizados para experimentación es de creciente interés público, tratamos de encontrar un modelo de reemplazo para permitir la proyección de diferentes bacterias inmunogénica propiedades. Insectos, especialmente Galleria mellonella, son un modelo de reemplazo utilizados en la investigación de la infección. G. mellonella combina diversas ventajas como bajos costos y alto rendimiento; permite la administración oral de bacterias, que es la vía natural, y permite la infección sistémica5,6. G. mellonella más permite la incubación a 37 ° C, que es la temperatura fisiológica del cuerpo de los mamíferos y el óptimo para la virulencia bacteriana factor expresión5. La principal ventaja de g. mellonella es el conservado sistema inmune innato que permite la discriminación del yo del no yo y codifica una gran variedad de receptores de reconocimiento de patrón como apolipophorin o las opsoninas hemolin6, 7. a partir del reconocimiento del microbio, g. mellonella puede desencadenar diferentes inmunorespuestas humorales aguas abajo. Pueden inducir respuestas de estrés oxidativo y secretan especies reactivas de oxígeno (ROS) que implica la actividad de la NOS (sintasa de oxidasa nítrica) y NOX (NADPH oxidasa)6,8. Además, g. mellonella activa una respuesta potente péptido antimicrobianos (AMP), que se traduce en la secreción de una mezcla de diferentes amperios como gloverin, moricin, cecropina o la Defensina-como gallerimycin6, 8,9,10. En general, amperios tienen especificidad del hospedador bastante amplio contra las bacterias Gram-positivas y gram-negativas y hongos y dar una respuesta potente ya que los insectos carecen de cualquier respuesta adaptativa10. Gloverin es un amplificador activo contra bacterias y hongos e inhibe la formación de membrana externa6,11. Moricins exhiben su función antimicrobiana contra bacterias Gram positivas y gram negativas por penetrar en la membrana y la formación de un poro9,11. Cecropinas proporcionan actividad contra bacterias y hongos y permeabilizar la membrana semejantemente como moricins9,10. Gallerimycin es un péptido de Defensina-como con propiedades anti-hongos9. Curiosamente, se encontró que la combinación de la cecropina y gallerimycin tuvieron una actividad sinérgica contra e. coli10.

Debido a su carácter de fácil uso g. mellonella larvas son un modelo de infección utilizadas para evaluar la patogenicidad bacteriana. En particular, los estudios en que los datos obtenidos de g. mellonella correlacionaron con datos obtenidos de ratones soporte la fuerza de este modelo de host alternativo. Se encontró que los serotipos más patógenos de Listeria monocytogenes en un modelo murino de infección también conducen a mayores tasas de mortalidad en g. mellonella después de la infección sistémica. Además, menos serotipos virulentos resultaron para ser también menos virulenta en el modelo de g. mellonella 12. Observaciones similares se han hecho con los hongos patógenos humanos Candida albicans. Virulencia de C. albicans de diferentes cepas ha sido evaluado por la infección sistémica y posterior seguimiento de supervivencia larval. Cepas avirulentas de ratón fueron avirulentas o exhiben reducida virulencia en g. mellonella, mientras que las cepas virulentas de ratón conducen también a alta mortalidad larvaria13. El modelo de g. mellonella adicional podría utilizarse para identificar los factores de patogenicidad de sistema tipo 3 secreción de Pseudomonas aeruginosa14.

Puesto que la mayoría de las investigaciones que involucran g. mellonella se centraron en factores de virulencia utilizando el enfoque sistémico infección estábamos especialmente interesados en proporcionar un método adecuado para el análisis de los comensales intestinales en una alimentación oral forzada modelo en el que podemos aplicar una dosis distinta de las bacterias por las larvas y no sólo observar la tasa de mortalidad larval pero analizar diferentes características de inmunorespuestas naturales para mantener la homeostasis intestinal.

Nuestro método ayuda a aumentar el uso de g. mellonella como un modelo de reemplazo ya que combinamos la aplicación de bacterias y el análisis de expresión de RNA. No sólo es útil reforzar el significado de los estudios de la patogénesis bacteriana cuando se incluye el análisis de las respuestas inmunes después de la administración oral y no sólo la observación de las tasas de mortalidad después de la infección sistémica. Nuestros métodos permite el análisis de las propiedades inmunogénicas de bacterias no patógenas comensales puesto que es proporciona condiciones más complejas que el cultivo celular, ofreciendo una barrera intestinal en un organismo vivo.

Protocol

1. cría de g. mellonella y preparación de las larvas de los experimentos Nota: El ciclo de huevo al último estadio la larva tarda aproximadamente 5-6 semanas. La transferencia de los huevos de la polilla adulta a las cajas de 2 L que contiene sustrato de polilla de la cera (grits de maíz 22%, 22% harina de trigo, cera de 17,5%, 11% leche desnatada en polvo, miel de 11%, 11% glicerol, levadura secadas de 5,5%). Realizar toda la cría a 30 ° C en la oscuridad. T…

Representative Results

El modelo de infección de g. mellonella hemolinfa en ampliamente utilizado para analizar los factores de virulencia de una gran variedad de patógenos. La mayoría las medidas incluyen el análisis de la mortalidad de las larvas, que es un método muy fácil. Sin embargo, este método no permite conclusiones sobre las respuestas inmunes en general y vincular los resultados de las respuestas inmunitarias de g. mellonella con mecanismos inmunes vertebrados. El modelo de l…

Discussion

El modelo de g. mellonella es un modelo frecuentemente utilizado para evaluar los factores de la virulencia bacteriana en una infección sistémica enfoque21. Puesto que muchos agentes patógenos y bacterias entran al host vía oral infección o colonización, nuevos conocimientos hay que encontrar para evaluar g. mellonella como un modelo de colonización oral y la infección.

La posibilidad de posterior g. mellonella entre 15 y 37 ° C es un…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por el DFG (SPP1656), el grupo de entrenamiento de investigación DFG 1708, el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) y el centro alemán de investigación de la infección (DZIF).

Materials

1.5 mL tubes Eppendorf 0030120086
100 bp DNA ladder  Thermo Fisher Scientific 15628019
1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) Sigma-Aldrich B9673
2 mL tubes Eppendorf 0030120094
2x Mangomix Bioline BIO-25033 Colony PCR
50 mL tubes Greiner Bio-One 210 261
Agarose Biozym 840004
Beeswax Mixed-Store.de  -
Brain heart infusion broth Thermo Fisher Scientific CM1135
CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Fisher Scientific K1232 Cloning vector for 16S fragments
Corn grits Ostermühle Naturkost GmbH 306 Organic cultivation
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Becton Dickinson BD
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Becton Dickinson 244610
DNA-free DNA Removal Kit  Thermo Fisher Scientific 244510  Dnase digestion
Dried yeast Rapunzel  - Organic cultivation
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14040
Ethanol VWR 20821.330
Glycerol Sigma-Aldrich W252506
Honey Ostermühle Naturkost GmbH 487
Isopropanol  VWR 20842.330
Lightcycler 480 Instrument II Roche Molecular Systems 5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Molecular Systems 4729692001
Manual Microsyringe Pump with Digital Display World Precision Instruments DMP
Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm Becton Dickinson 324826 Oral administration
Mortar, unglazed VWR 410-9327 
Nanodrop Thermo Fisher Scientific 13-400-518
Nuclease-free water  Thermo Fisher Scientific 10977035
Oxoid AnaeroGen sachets  Thermo Fisher Scientific AN0025A Quality and quantity of RNA
PCR stripes Biozym 710970
Pestle, unglazed grinding surface VWR 410-9324 
Phusion proof-reading enzyme  Thermo Fisher Scientific F553S
Primers Biomers  -
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1222
QuantiFast SYBR Green PCR kit  Qiagen 204056 qPCR for bacterial copy number measurment
QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit  Qiagen 204156 qRT-PCR for gene expression measurements
QuantiTect Reverse Transcription Kit  Qiagen 205311 cDNA synthesis
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Scientific Q32856
Qubit dsHS DNA kit  Thermo Fisher Scientific Q32851 Quantification of plasmid and cDNA samples
Qubit fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33226 Quantification of plasmid and cDNA samples
RNase-ExitusPlus AppliChem A7153
Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Skimmed milk powder Sucofin  -
SYBR safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
TRI reagent  Sigma-Aldrich T9424
Weighing boat VWR 10803-148
Wheat meal Ostermühle Naturkost GmbH 6462 Organic cultivation

References

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Cite This Article
Lange, A., Schäfer, A., Frick, J. A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses. J. Vis. Exp. (145), e59270, doi:10.3791/59270 (2019).

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