Bir Galleria mellonella Oral yönetim modeli için Study Commensal-Induced doğuştan gelen bağışıklık yanıtı
Summary
Burada, biz Galleria mellonella larva kullanarak bir sözlü yönetim modeli için detaylı bir protokol sağlar ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı nasıl karakterize indüklenen. Bu iletişim kuralını kullanan, pratik deneyimi olmayan araştırmacılar G. mellonella yöntemi kuvvet kullanmak mümkün olacak.
Abstract
Ana bağışıklık sistemi üzerinde Komensal bakteriler immünojenik potansiyelinin incelenmesi bir temel bağırsak ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri okurken bileşenidir. De farklı commensals ana bağırsak bağışıklık sistemini uyarmak için farklı bir potansiyel sergi kuruldu. Bu tür araştırmalar omurgalı hayvanlar, özellikle kemirgenler içerir. Beri artan etik kaygılar omurgalılar içeren deneyler ile bağlantılı, omurgasız yedek modelleri için yüksek bir talep vardır.
Burada, biz komensal sigara Patojen bakteriler ve commensals immünojenik potansiyelini ortaya çıkarmak mümkün değerlendirmenin G. mellonella bağışıklık sistemi üzerinde kullanarak Galleria mellonella sözlü yönetim modeli sağlar. G. mellonella Bacteroides vulgatus ve Escherichia coligibi farklı immünojenik potansiyeli olan commensals analiz sağlar model yararlı alternatif omurgasız değiştirme olduğunu ispat. İlginçtir, bakteri öldürme etkilemez larvalar, memeliler için benzer olduğu sergiledi. G. mellonella bağışıklık yanıtı omurgalı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ile karşılaştırılabilir ve bakteri tanınması ve antimikrobiyal moleküllerin üretimini içerir. Önerdiğimiz G. mellonella sağlıklı memeli bireylerin bilinen önceki microbiota dengeyi yeniden başardı. G. mellonella ve omurgalıların karşılaştırılabilir doğuştan gelen bağışıklık yanıtları sağlayan rağmen G. mellonella edinilmiş bağışıklık sistemi liman değil. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin incelenen bileşenleri korunmuş evrimsel olduğundan, model bakteriyel immünojenik özellikleri prescreening ve ilk analiz sağlar.
Introduction
Bağırsak microbiome homeostazı bakım için gerekli bir bileşenidir ve her ikisi de doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı1,2içerir. Komensal microbiota toplum tarafından farklı ana komensal bileşenlerinin karakterizedir: yararlı etkileri önemli immunomodulatory fonksiyonları ve zararlı etkileri genetik olarak yatkın olabilir pathobionts tarafından tevdi simbiont ev sahipliği yapan ve teşvik ve bağırsak iltihabı3,4tetikler. Birçok çalışma simbiont ve pathobionts ve onların etkisi ana bağışıklık sistemi esas olarak edinilmiş bağışıklık yanıtı eğitim yayınlanmıştır.
İncelemeler ve korunması için birçok hayvan dahil bu çalışmaları ve kamu yararı artan deney için kullanılan hayvanların yerini beri immünojenik farklı bakteriyel bir tarama için izin vermek için model değiştirme bulmak için aramak özellikleri. Böcekler, özellikle Galleria mellonella, enfeksiyon araştırma bir çok kullanılan yedek modeli olan. G. mellonella düşük maliyet ve yüksek işlem hacmi gibi farklı avantajlarını birleştiren; bakteri doğal poz yol olan sözlü yönetimine izin verir ve sistemik enfeksiyon5,6için sağlar. G. mellonella daha da kuluçka 37 ° c °, memeliler ve bakteriyel virülans faktörü ifade5için optimum fizyolojik vücut sıcaklığını sağlar. Korunmuş doğuştan gelen bağışıklık sistemi kendi kendine ayırımcılığa karşı olmayan kendine sağlar ve desen tanıma reseptörleri apolipophorin veya bağlar hemolin6, gibi çeşitli kodlar G. mellonella büyük avantajı olduğunu 7. mikrop tanıma farklı akış aşağı humoral bağışıklık yanıtı G. mellonella tetikleyebilir. Bu oksidatif stres yanıt teşvik ve Reaktif oksijen türlerine (ROS) NOS (nitrik oksidaz synthase) ve NOX (NADPH oksidaz)6,8aktivite içeren salgılar. Buna ek olarak, gloverin, moricin, cecropin veya defensin benzeri gallerimycin6, gibi farklı amper karışımı salgılanmasını sonuçlanan bir güçlü antimikrobiyal peptid (AMP) yanıt G. mellonella etkinleştirir 8,9,10. Genellikle, amper gram pozitif ve gram-negatif bakteri ve mantar karşı oldukça geniş ana bilgisayar özgüllük ve böcekler herhangi bir adaptif yanıt10eksik olan bu yana güçlü bir yanıt sağlamak zorunda. Gloverin bakteri ve mantar karşı etkin bir AMFİ ve dış membran oluşumu6,11engeller. Moricins membran delici ve gözenek9,11şekillendirme antimikrobiyal işlevlerine gram pozitif ve gram-negatif bakteri karşı sergi. Cecropins bakteri ve mantar karşı etkinliği sağlamak ve membran moricins9,10gibi benzer şekilde permeabilize. Gallerimycin anti-mantar özellikleri9defensin benzeri peptid var. İlginçtir, bu cecropin ve gallerimycin ile birlikte E. coli10karşı sinerjik bir etkinlik vardı bulundu.
Onların kullanımı kolay karakter G. mellonella nedeniyle larva bakteriyel patojenitesi değerlendirmek için bir sık kullanılan enfeksiyon modeli vardır. Özellikle, G. mellonella elde edilen veri çalışmalarda fareler çekmek–dan bu alternatif ana modeli gücünü elde edilen verilerle aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Listeria Monositogenez en patojenik serotipleri bir fare enfeksiyon modelinde de G. mellonella yüksek mortalite oranları için sistemik enfeksiyon sonra yol bulundu. Daha fazla, daha az öldürücü serotipleri de G. mellonella model12‘ daha az zehirli olduğu ortaya çıktı. Benzer gözlemler insan patojenik mantarlar Candida albicansile yapılmıştır. Virülans farklı C. albicans suşları değerlendirildi sistemik enfeksiyon ve sonraki larva yaşama izleyerek. Fare olmayan suşlar da olmayan ya da sergilenen fare öldürücü soy da yüksek larva ölüm13kurşun ise G. mellonella, virülans azaltılmış. G. mellonella modeli daha fazla tür 3 salgı sistemi patojenitesi faktörler Pseudomonas aeruginosa14tanımlamak için kullanılabilir.
Çoğu araştırmalar G. mellonella içeren sistemik enfeksiyon yaklaşımı kullanarak virülans faktörleri üzerinde durulmuştur beri biz bir sözlü kuvvet içinde bağırsak commensals analizi için uygun bir yöntem sağlayan özellikle ilgi vardı hangi biz bakteri larva başına ayrı bir doz uygulanır ve larva ölüm oranı sadece gözlemlemek ama doğuştan gelen bağışıklık yanıtı bağırsak homeostazı korumak için farklı işaretlerinden analiz modeli.
Bizim yöntem biz bakteri uygulanması ve RNA ifade analizi birleştirmek beri model değiştirme olarak G. mellonella kullanımını artırmak için yardımcı olur. Sadece sözlü yönetim ve sadece ölüm oranları gözlem sistemik enfeksiyon sonra sonra bağışıklık yanıtı analizi de dahil olmak üzere zaman bakteriyel Patogenez çalışmalar anlamını güçlendirmek yararlı değildir. Bizim yöntemleri sağlar bakteriyel immünojenik özellikleri analiz için patojenik olmayan bu yana commensals yaşayan bir organizma bir bağırsak bariyer sunarak hücre kültürü daha daha karmaşık koşullar sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
G. mellonella modeli bir sistemik enfeksiyon yaklaşım21bakteriyel virülans faktörleri değerlendirmek için sık kullanılan bir modeldir. Bu yana birçok patojenler ve bakteri ana bilgisayar yolu ile sözlü kolonizasyon veya enfeksiyon yol girin, yeni anlayışlar G. mellonella sözlü kolonizasyon ve enfeksiyon için bir model olarak değerlendirmek için bulunmak gerekiyor.
Vücut sıcaklığı 37 ° C5en memeli modeller…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser enfeksiyon araştırma (DZIF) (SPP1656) DFG, DFG araştırma eğitim grubu 1708, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) ve Alman Merkezi tarafından finanse edildi.
Materials
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
