ハチミツガ口腔管理モデル Study Commensal-Induced 自然免疫応答
Summary
ここでは、我々 はハチミツガの幼虫を用いた経口投与モデルの詳細なプロトコルを提供し、特徴付ける方法による自然免疫応答。このプロトコルを使用して、実用的な経験のない研究者はg. mellonellaメソッドを強制的を使用することができます。
Abstract
ホストの免疫システムの共生細菌の免疫原性の可能性の調査は、腸宿主微生物間相互作用の勉強 1 つの重要なコンポーネントです。まあ、別の共生生物が宿主の腸管免疫系を刺激するために異なる可能性を示すことを設立します。このような調査は、脊椎動物、特に齧歯動物を含みます。増加の倫理的な問題は、脊椎動物を含む実験でリンクされるので、無脊椎動物の代替モデルのための高需要があります。
ここでは、 g. mellonellaの免疫システムの共生非病原性細菌と共生生物の免疫原性の可能性の可能な評価を使用してハチミツガ経口投与モデルを提案します。G. mellonellaがvulgatus バクテロイデスや大腸菌など別の免疫原性の可能性と共生生物を分析できるようにする有用な代わりとなる無脊椎動物取り替えモデルであることを示します。興味深いことに、細菌を起こしません殺害に及ぼす幼虫は、哺乳類に似ています。G. mellonellaの免疫応答は、脊椎動物の生得の免疫反応と同等であったし、細菌の認識および抗菌分子の生産を含みます。G. mellonellaが復元前の微生物叢バランスを健全な哺乳類の個人から知られていることを提案します。G. mellonellaと脊椎動物の両方に匹敵する自然免疫応答を提供しが、 G. mellonellaは適応免疫系を抱いていません。生得の免疫組織の調査のコンポーネントが保存されて進化を遂げて以来、モデルで細菌の免疫原性プロパティの事前チェックと分析できます。
Introduction
腸内マイクロバイ オームの恒常性の維持のために不可欠なコンポーネントをおよび両方の自然免疫と適応免疫応答1,2が含まれます。共生微生物叢コミュニティは異なった主成分共生によって特徴付けられる: 重要な免疫調節機能と遺伝的傾向有害な影響を持つことができます pathobionts の有益な効果を与える共生ホストを促進・炎症性腸3,4をトリガーします。共生と pathobionts に関する多くの研究とその宿主の免疫系に及ぼす影響は、適応免疫応答を主に勉強して公開されています。
免疫原性の異なる細菌のスクリーニングを可能にする交換用のモデルを検索しよう以来、これらの研究を含む多くの動物調査及び保護のため、実験に使用される動物の交換が公共の利益を増やすことでプロパティ。昆虫、特にハチミツガは、感染症の研究で広く使用されている交換用のモデルです。G. mellonellaは、低コスト、高スループットなど別の利点を組み合わせた自然暴露経路である細菌の経口投与し、全身性感染症5,6のこと。G. mellonellaさらには哺乳類と細菌の病原性因子式5のための最適の生理的体温である 37 ° C で培養できます。G. mellonellaの主な利点は、保存された自然免疫系は非自己から自己の差別を有効にし、さまざまな apolipophorin やオプソニン ヘモリン6,のようなパターン認識の受容器を符号化する7. g. mellonella微生物認識時に異なるダウン ストリーム体液性免疫を引き起こすことができます。酸化ストレス応答を誘導でき、NOS (硝酸酸化酵素合成酵素) や NOX (NADPH オキシダーゼ)6,8の活動では、活性酸素種 (ROS) を分泌します。さらに、 G. mellonellaは、gloverin、moricin、セクロピン ディフェンシンのような gallerimycin6,などの異なるアンプの混合物の分泌による強力な抗菌ペプチド (AMP) の応答をアクティブに8,9,10。一般に、アンプはグラム陽性およびグラム陰性の細菌やカビに対して非常に広い宿主特異性を有し、昆虫の適応応答10本が欠けているので、強力な応答を提供する必要があります。Gloverin は細菌やカビに対してアクティブ アンプで、外膜形成6,11を抑制します。Moricins は、膜を貫通し、細孔9,11を形成グラム陽性およびグラム陰性の細菌に対する抗菌機能を展示します。Cecropins は細菌および真菌に対して活動を提供し、同様に moricins9,10のような膜を permeabilize します。Gallerimycin は抗真菌特性9ディフェンシンのようなペプチドです。興味深いことに、セクロピンと gallerimycin の組み合わせがエシェリヒア属大腸菌10に対して相乗的な活性を持っていたことが分かった。
自分の使いやすい文字g. mellonella幼虫が細菌の病原性を評価するために頻繁に使用される感染症モデル。特に、 G. mellonellaから得られるデータの研究は、この代替ホスト モデルの強度マウス サポートから得られたデータと関連付けてください。全身性感染症後にマウス感染モデルにおけるリステリア菌の最も病原血清型をg. mellonellaの高い死亡率につながるもわかった。さらに、以下の病原血清型が判明もg. mellonellaモデル12により少なく劇毒性であること。人間の病原真菌カンジダ ・ アルビカンスと同様の観測が行われました。病原性全身性感染症と幼虫生存率のモニタリングによって異なるC. albicansの系統が評価されました。マウス非病原性菌株も非病原性または展示マウス病原性菌株リードも高いため幼虫死亡率13に対し、 g. mellonella、病原性を削減します。G. mellonellaモデルは、緑膿菌14の 3 型分泌システム病原性要因を識別するためにさらに使用できます。
特に経口強制的に腸内共生生物を解析に適した方法を提供することに興味を持っていたg. mellonellaを含むほとんどの調査された全身性感染症のアプローチを使用して病原因子に焦点を当てたのでモデル、我々 幼虫ごと細菌の異なる用量を適用しだけでなく幼虫の死亡率を観察が腸内の恒常性を維持するために免疫反応の異なる特徴を分析します。
本手法は、我々 は細菌のアプリケーションおよび RNA 発現の解析を組み合わせるため交換用のモデルとしてg. mellonellaの使用を増やすのに役立ちます。じゃないだけ経口投与だけでなく全身性感染症後の死亡率の観察後の免疫応答の解析を含むとき病原細菌研究の意味を強化するために役立ちます。私たちの方法は、細菌の免疫原性の性質の解析非病原性共生生物だから生きている有機体の腸粘膜バリアーを提供することによって細胞培養よりも複雑な条件を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
G. mellonellaモデル全身性感染症アプローチ21で細菌の病原性因子を評価するために頻繁に使用されるモデルです。多くの病原体や細菌、口腔の植民地や感染ルート経由でホストを入力、新しい洞察力口腔植民地化および伝染のためのモデルとしてg. mellonellaの評価を発見する必要があります。
後部G. mellonella 15-37 ° C の間に可能性は大き…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は感染症研究 (DZIF) のためのドイツ センター同毛皮 Bildung und 上海虹橋 (BMBF)、DFG 研究訓練グループ 1708 DFG (SPP1656) によって賄われていた。
Materials
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
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