Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para um modelo de administração oral usando Galleria mellonella larvas e como caracterizar induzido inatas respostas imunes. Usando este protocolo, será capazes de usar a alimentação forçada método mellonella g. pesquisadores sem experiência prática.
A investigação do potencial imunogênico de bactérias comensais sobre o sistema imunológico do hospedeiro é um componente essencial ao estudar interações do anfitrião-micróbio intestinal. Está bem estabelecido que os comensais diferentes apresentam um potencial diferente para estimular o sistema imunitário intestinal do hospedeiro. Tais investigações envolvem animais vertebrados, especialmente roedores. Que crescentes preocupações éticas estão relacionadas com a realização de experiências com vertebrados, existe uma alta demanda por modelos de invertebrados substituições.
Aqui, nós fornecemos um modelo de administração oral de Galleria mellonella usando bactérias não-patogênicas são comensais e a possível avaliação do potencial imunogênico de comensais no sistema imunitário mellonella g. . Demonstramos que mellonella g. é um modelo de substituição de invertebrados alternativa útil que permite a análise dos comensais com potencial imunogênico diferente tais como Bacteroides vulgatus e Escherichia coli. Curiosamente, as bactérias não exibiram nenhum efeito sobre as larvas, que é semelhante para os mamíferos. As respostas imunes de g. mellonella eram comparáveis com respostas de imunes inatas vertebradas e envolvem a produção de moléculas antimicrobianas e reconhecimento das bactérias. Propomos que mellonella g. foi capaz de restaurar o equilíbrio anterior de microbiota, que é bem conhecido de indivíduos saudáveis de mamíferos. Apesar de fornecer respostas de imune inatas comparáveis em vertebrados e mellonella g. , g. mellonella não abriga um sistema imune adaptativo. Desde que os investigados componentes do sistema imunitário inato são evolutivos conservada, o modelo permite uma análise prescreening e primeira de propriedades imunogênicas bacterianas.
A microbiome intestinal é um componente essencial para a manutenção da homeostase e envolve ambas as respostas de imune inata e adaptativa1,2. A Comunidade microbiota comensal é caracterizada por diferentes componentes principais de comensais: simbiontes que conferem efeitos benéficos por funções immunomodulatory importante e pathobionts que pode ter efeitos prejudiciais geneticamente predispostos hospeda e promover e provocar inflamação intestinal3,4. Muitos estudos sobre simbiontes e pathobionts e sua influência sobre o sistema imunológico do hospedeiro têm sido publicados principalmente estudar respostas imunes adaptáveis.
Uma vez que estes estudos envolvem muitos animais para as investigações e a proteção e a substituição dos animais utilizados para experimentação é de aumentar o interesse público, buscamos encontrar um modelo de substituição para permitir a exibição de diferentes bactérias imunogênicas Propriedades. Insetos, especialmente Galleria mellonella, são um modelo de substituição amplamente utilizado na investigação de infecção. G. mellonella combina diferentes vantagens como baixo custo e alto rendimento; Ele permite que a administração oral de bactérias, que é a rota de exposição natural, e permite a infecção sistêmica5,6. G. mellonella mais permite a incubação a 37 ° C, qual é a temperatura do corpo fisiológico de mamíferos e o ideal para o factor de virulência bacteriana expressão5. A principal vantagem do mellonella g. é conservado sistema imunitário inato que permite a discriminação do self da não-auto e codifica uma variedade de receptores de reconhecimento padrão como apolipophorin ou o opsoninas hemolin6, 7. sobre reconhecimento de micróbio, g. mellonella pode desencadear respostas diferentes a jusante imune humorais. Pode induzir respostas de estresse oxidativo e secretam espécies reativas de oxigênio (ROS), que envolve a atividade de n º s (oxidase nítrico sintase) e NOX (oxidase de NADPH)6,8. Além disso, g. mellonella ativa uma resposta potente peptídeo antimicrobiano (AMP), que resulta na secreção de uma mistura de AMPs diferentes tais como gloverin, moricin, Cecropina ou o defensina-como gallerimycin6, 8,9,10. Geralmente, amplificadores têm bastante amplo acolhimento especificidade contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas e fungos e tem que dar uma resposta potente, desde que os insetos estão faltando qualquer resposta adaptativa10. Gloverin é um amplificador ativo contra bactérias e fungos e inibe a formação de membrana exterior6,11. Moricins exibem sua função antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas por penetrar a membrana e formando um poro9,11. Cecropins fornecer atividade contra bactérias e fungos e permeabilize a membrana da mesma forma como moricins9,10. Gallerimycin é um peptídeo de defensina-como com propriedades anti-fúngicos9. Curiosamente, verificou-se que a combinação de Cecropina e gallerimycin tinha uma atividade sinérgica contra e. coli10.
Devido ao seu caráter de easy-to-use mellonella g. as larvas são um modelo de infecção frequentemente usados para avaliar a patogenicidade bacteriana. Em particular, estudos em que dados obtidos de g. mellonella correlacionam com dados obtidos de ratos apoio a força deste modelo hospedeiro alternativo. Verificou-se que os serótipos mais patogênicos de Listeria monocytogenes em um modelo de infecção do rato também conduzem a maiores taxas de mortalidade em g. mellonella após infecção sistêmica. Além disso, menos serotipos virulentos acabou por ser também menos virulentos no modelo mellonella g. 12. Observações semelhantes foram feitas com os fungos patogênicos humanos Candida albicans. Virulência de c. albicans de diferentes estirpes tenha sido avaliada por infecção sistêmica e posterior acompanhamento de sobrevivência larval. Cepas avirulentas mouse também foram expostas ou avirulentas reduzida virulência em g. mellonella, Considerando que as estirpes virulentas rato conduzem também a alta mortalidade larval13. O modelo de g. mellonella mais poderia ser usado para identificar fatores de patogenicidade de sistema tipo 3 secreção de Pseudomonas aeruginosa14.
Desde que a maioria das investigações que envolvem mellonella g. concentraram-se em fatores de virulência usando a abordagem de infecção sistêmica estávamos especialmente interessados em fornecer um método adequado para a análise dos comensais intestinais em uma alimentação oral forçada modelo em que podemos aplicar uma dosagem distinta de bactérias por larvas e não apenas observar a taxa de mortalidade larval mas analisar diferentes marcas da inatas respostas imunes para manter a homeostase intestinal.
Nosso método ajuda a aumentar o uso de g. mellonella como um modelo de substituição, desde que combinamos a aplicação de bactérias e a análise da expressão do RNA. Não só é útil reforçar o significado dos estudos de patogênese bacteriana quando incluindo a análise das respostas imunes após administração oral e não apenas a observação das taxas de mortalidade após infecção sistêmica. Nossos métodos permite que para a análise das propriedades imunogênicas de bactérias não-patogênicas comensais desde que é fornece condições mais complexas do que a cultura celular, oferecendo uma barreira intestinal em um organismo vivo.
O modelo de g. mellonella é um modelo frequentemente usado para avaliar os fatores de virulência bacteriana em uma abordagem de infecção sistêmica21. Desde que muitos patógenos e bactérias entrarem o hospedeiro através da rota de colonização ou infecção oral, novos insights precisam ser encontrado para avaliar mellonella g. como um modelo para a colonização oral e infecção.
A possibilidade de traseira mellonella g. entre 15 e 3…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo DFG (SPP1656), o grupo de formação de pesquisa DFG 1708, o Bundesministerium für Bildung und pesquisa (BMBF) e o centro alemão para pesquisa de infecção (DZIF).
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
Ethanol | VWR | 20821.330 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
PCR stripes | Biozym | 710970 | |
Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
Primers | Biomers | - | |
PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |