一种研究食细胞诱导免疫应答的 mellonella 口服液模型
Summary
在这里, 我们提供了一个详细的协议, 口服给药模型使用大肠杆菌 mellonella幼虫和如何表征诱导的先天免疫反应。使用该协议, 没有实际经验的研究人员将能够使用g. mellonella强制喂养方法。
Abstract
研究同源细菌对宿主免疫系统的免疫原学潜能是研究肠道宿主-微生物相互作用的重要组成部分。众所周知, 不同的配菜表现出不同的刺激宿主肠道免疫系统的潜力。这类调查涉及脊椎动物, 特别是啮齿类动物。由于越来越多的伦理问题与涉及脊椎动物的实验有关, 因此对无脊椎动物替代模型的需求很大。
在这里, 我们提供了一个利用共生菌的大肠杆菌口服给药模型, 并可能评估对g. mellonella免疫系统的免疫原学潜力。我们证明, g. mellonella是一个有用的替代无脊椎动物替代模型, 允许分析具有不同免疫原性潜力的相关物质, 如细菌硫化细菌和大肠杆菌。有趣的是, 这种细菌对幼虫没有杀灭作用, 而幼虫与哺乳动物相似。g. mellonella 的免疫反应与脊椎动物的先天免疫反应相当, 涉及细菌的识别和抗菌分子的产生。我们建议 g . mellonella 能够恢复以前的微生物群平衡, 这是众所周知的健康哺乳动物个人。虽然在g. mellonella和脊椎动物中都提供了类似的先天免疫反应,但 g. mellonella 并不具有适应性免疫系统。由于所研究的先天免疫系统的成分是进化保存的, 该模型允许预先创造和首次分析细菌免疫原性。
Introduction
肠道微生物群是维持体内平衡的重要组成部分, 涉及先天和适应性免疫反应1,2。共生组织的特征是不同的主要共生体成分: 通过重要的免疫调节功能产生有益作用的共生体, 以及对遗传倾向有有害影响的病理体主持、促进和引发肠道炎症3,4。许多关于共生体和病理及其对宿主免疫系统影响的研究已经发表, 主要研究适应性免疫反应。
由于这些研究涉及许多动物进行调查, 保护和更换用于实验的动物越来越引起公众的兴趣, 我们寻求找到一种替代模式, 以便对不同的细菌免疫原性进行筛查性能。昆虫, 特别是大肠杆菌, 是感染研究中广泛使用的替代模型。g. mellonella结合了不同的优势, 如低成本和高吞吐量;它允许口服细菌, 这是自然接触途径, 它允许全身感染5,6。在37°c 条件下进一步促进了培养, 而13°c 是哺乳动物的生理体温, 也是细菌毒力因子表达的最佳选择.g. mellonella 的主要优点是保守的先天免疫系统, 它能够区分自己从非自我和编码各种模式识别受体, 如阿波霍林或视黄素血肉 6, 7. 微生物识别后, g. mellonella 可引发不同的下游体液免疫反应。它能诱导氧化应激反应, 分泌活性氧 (ros), 涉及 nos (一氧化酶合酶) 和 nox (nadph 氧化酶)6,8的活性。此外, g. mellonella 激活了有效的抗菌肽 (amp) 反应, 从而导致不同的 amp 混合物的分泌, 如格列维素、莫利星、塞科品或防御素样的格列米星 6, 8,9,10。一般来说, Amp 具有相当广泛的宿主特异性, 以对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌和真菌, 并必须提供一个强有力的反应, 因为昆虫缺乏任何适应性反应 10。格洛维林是一种对细菌和真菌具有活性的 AMP, 抑制膜外膜形成6,11。莫司菌素通过穿透膜并形成一个毛孔 9,11,显示出它们对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌作用。cecropins 提供对细菌和真菌的活性, 并像莫利辛 9,10一样渗透膜。Gallerimycin 是一种具有抗真菌特性的防御素样肽9。有趣的是, 发现西罗平和金霉素联合对大肠杆菌10有协同作用。
由于其易于使用的性质g. mellonella 幼虫是一个经常使用的感染模型, 以评估细菌的致病性。特别是, 从g. mellonella 获得的数据与从小鼠获得的数据相关的研究支持了这一替代宿主模型的强度。研究发现, 小鼠感染模型中最致病性的单核细胞增生李斯特菌血清型也导致全身感染后g. mellonella死亡率较高。此外, 在12 型 g. mellonella中, 毒性较低的血清型也较少.对人类病原真菌白色念珠菌也进行了类似的观察。通过全身感染和随后对幼虫存活的监测, 对不同的白色念珠菌病类毒力进行了评估。小鼠无毒菌株也具有无毒性或毒性降低, 而小鼠毒株也可导致高幼虫死亡率 13.g. mellonella模型可进一步用于识别铜绿假单胞菌14的3型分泌系统致病性因素。
由于大多数涉及g. mellonella 的研究都集中在使用全身感染方法的毒力因素上, 因此我们特别感兴趣的是提供一种适合于口服强制喂养中的肠道同源物分析的方法模型, 我们可以应用不同剂量的细菌每幼虫, 不仅观察幼虫死亡率, 但分析先天免疫反应的不同标志, 以保持肠道稳态。
我们的方法有助于增加使用 g. mellonella 作为替代模型, 因为我们结合细菌的应用和 rna 表达的分析。在包括口服后免疫反应分析和全身感染后死亡率观察的同时, 加强细菌发病机制研究的意义不仅是有益的。我们的方法允许分析细菌非致病性共济会的免疫原性特性, 因为它通过在活生物体中提供肠道屏障, 提供了比细胞培养更复杂的条件。
Protocol
Representative Results
Discussion
g. mellonella模型是一种常用的模型, 用于评估全身感染方法21中的细菌毒力因素。由于许多病原体和细菌通过口腔定植或感染途径进入宿主, 需要找到新的见解来评估g. mellonella 作为口腔定植和感染的模型。
在15-37°c 之间饲养g. mellonella 的可能性是一个很大的优势, 因为大多数哺乳动物模型的体温保持在 37°c 5。g. mellonella…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由 DFG (SPP1656)、DFG 研究培训小组1708、Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) 和德国感染研究中心 (DZIF) 资助。
Materials
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
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