膜をターゲットとした Ca^{2 +}インジケーターによる培養細胞のローカル Ca^{2 +}シグナルの解剖

ここで説明したすべての実験は、文部科学省によって発行されたガイドラインによると理化学研究所安全委員会および動物実験委員会によって承認されました。 1. 細胞の調製 ポリ (エチレンイミン) の準備-coverslips をコーティング注:ポリエチレンイミン (PEI) コーティングをガラス器具の推奨しますニューロンとアストロ サイトの開発を妨げることがなく、coverslips にしっかりと接続することができます。ただし、他のコーティング方法 (例えば、ポリ オルニチン、ポリ L-リジン, ラミニン コーティング) もあり、ガラス底培養皿のため必要な場合。 12 ウェル プレートの各ウェルに、18 mm 径のガラス基板を配置します。滅菌水を使用して 0.04 %pei ソリューション (12.5 mL/12 ウェル プレート) を準備します。 各ウェルに 0.04 %pei 溶液 1 mL を追加します。Coverslips 下に気泡がないことを確認します。 37 ° C で一晩 CO2インキュベーターの版を孵化させなさい 次の日、洗浄コーティング coverslips 3 x 1 ml の滅菌水。ヒメアリ PEI ソリューションを削除各ウェルに 1 mL の滅菌水を追加して、12 ウェル プレートを振る、coverslip とプレートの間ペイ ソリューション徹底的に洗浄することができます。同様に残りのペイは細胞のために有毒を確認水後最終的な洗浄が完全に吸気します。 乾燥し、紫外線 (UV) 少なくとも 15 分光フード内側 coverslips を滅菌します。ペイ コート皿は、2 ヶ月の 4 ° C で保存できます。ちょうど使用する前に 15 分間紫外線を料理を照らします。 培地の蒸発を防ぐために井戸の間のスペースに 5 mL の滅菌蒸留水を追加します。 セルラインをめっき注:このプロトコルは、HeLa 細胞など COS 7 細胞の哺乳類細胞から細胞へのトランスフェクションのちょうど 1 つの例を提供します。ユーザーは、彼らの実験用に最適化されたその他のトランスフェクション プロトコルを適用できます。このセクションでは COS 7 細胞 HeLa 細胞培養のプロトコルについて述べる. 70-90% の合流点に達するまで、トランスフェクション前日に 10 cm 培養皿の細胞を培養します。 培養液を prewarm (材料の表を参照) を 37 ° C 2 セルを洗浄せず Ca2 +と Mg2 + (PBS [-]) リン酸緩衝生理食塩水で x。 吸引、PBS(-)、0.5% トリプシン エチレンジアミン四 edta 溶液の 1 mL を追加し、37 ° C、90 で細胞をインキュベート s 円形に達するまで。 Prewarmed 培地、trypsinization を停止の 9 つの mL を追加します。1:6 の比率で培養培地で細胞を希釈します。 シード 12 ウェル プレートでペイ コート coverslips に希薄化後のセルの 1 つの mL です。 ラットやマウスの海馬ニューロン ・ グリアの混合文化の準備注:セクション 1.3 と 1.4 最初確認する必要が制度的ケアおよび使用委員会によって承認され、ケアと実験動物の使用のための正式に承認された手順に従う必要があります。神経細胞培養のプロトコルのフローチャートを図 2に示します。 層流フードの下ですべての試薬を準備します。場所ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) に 2 つの 100 mm 冷蔵庫内にある (およそ 20 mL/料理) 料理を文化します。 DMEM と 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) 成る郭清培地の 50 mL を準備 (材料の表を参照してください) 3 60 mm 培養皿 (約 7 mL/料理) と 8 35 ミリメートルに培地を分注、培養皿 (約 2 mL/料理)。別の冷蔵庫に料理を配置します。 20 mM HEPES (材料の表を参照) を添加したハンクス バランスの取れた塩溶液から成る、インキュベーション食塩水 50 mL を準備し、氷の上の 15 mL の円錐管に 8 mL の生理食塩水を配置します。 最小必須培地 (MEM) で、めっき培 B-27、グルタミン、ペニシリン ・ ストレプトマイシン (材料の表を参照) を準備します。この培地で室温 (20-28 ° C) を維持します。 70% エタノールで手術器具を滅菌します。 ふたとイソフルランの 1 mL のガラス瓶に紙タオルを置きます。1 分の蒸発イソフルランをしましょう。 1.3.6 のステップにしたがって調製された jar の妊娠ラットまたはマウスを配置し、深くに麻酔がかかるまで瓶の中動物を維持 (約 30 秒 〜 1 分)。 瓶から麻酔下の動物を取るし、70% エタノールでそれらを噴霧して動物と解剖機器を消毒します。標準的な解剖はさみとピンセットと腹側正中線を切り取って子宮を妊娠ラットまたはマウスから抽出します。 麻酔下の雌ラットまたはマウス、繊細な解剖はさみを使用しての子宮から E18-19 胚を抽出し、冷たい麻酔 10 cm 皿に冷たい DMEM にリング鉗子で抽出された胚を配置します。 細かい解剖はさみで胎児の首をはねるし、10 cm 皿に冷たい DMEM に頭を配置します。 13 センチ Semken 鉗子、鉗子罰金のヒントとそれぞれの胚から脳を抽出します。60 mm ディッシュに冷たい解剖中に脳をしてください。 35 mm 料理冷たい解剖中の罰金のヒント 2 つの鉗子を使用して、なったを削除し、氷の上の 15 mL の円錐管にインキュベーション生理食塩水の分離のティッシュの維持します。 インキュベーション生理食塩水となったを洗浄し、37 ° C で 5 分間インキュベーション生理食塩水でトリプシン (1.25 mg/mL) と DNase 私 (0.25 mg/mL) インキュベート推奨培養量は培養生理食塩水、ストック トリプシン x 20 の 150 μ L と 20 x の在庫 DNase の 150 μ L 2.7 mL (材料の表を参照してください)。 なった 3 を洗って冷たい培養生理食塩水で x。 インキュベーション生理食塩水を吸引し、DNase を含むめっき培地 1 mL を加える私 (原液の 10 μ L;材料の表を参照してください)。ピペッティング以上 20 x で組織を中断し、細胞カウンターとトリパン ブルーの試金を使用して、実行可能なセルの密度を測定します。 1.4 倍 105実行可能な細胞/ml ラット用と 2.5 105実行可能な細胞/ml マウスの倍の密度に海馬の細胞を希釈します。12 ウェル培養皿でペイ被覆カバーガラス上希薄細胞懸濁液の 1 mL の種子します。 2-3 日の CO2 インキュベーターで 37 ° C で細胞を維持します。 メッキ媒体を削除します。細胞の乾燥をさせてください。慎重かつ迅速に追加 prewarmed 維持培地 (材料の表を参照してください)。 ラット大脳皮質ニューロン ・ グリア混合培養・凍結細胞冷凍文化の復活の準備注:大脳皮質細胞の凍結保存方法は記述されていた previously11 だったここでは、大脳皮質細胞がする少なくとも 3 ヶ月間-80 ° C で保存ことができます修正されたプロトコルが提供されます。このプロトコルのフローチャートを図 2に示します。 めっき中の手順 1.3.1–1.3.4 と材料表のとおりで、培養生理食塩水、解剖中 DMEM を準備します。 DMEM、熱不活化牛胎児血清、ペニシリン ・ ストレプトマイシン (材料の表を参照) で構成され洗浄メディアの準備、必要に応じて。 麻酔下の雌ラットまたはマウス、繊細な解剖はさみを使用しての子宮から E18-19 胚を抽出し、冷たい麻酔冷たい DMEM にそれぞれの抽出された胚を配置するリング鉗子を使用します。 胚から脳を外し、冷たい解剖中でそれらを保ちます。見出せなかったを削除し、氷の上の 15 mL の円錐管にインキュベーション生理食塩水でそれらを維持します。 皮質培養生理食塩水での洗浄し、トリプシン (1.25 mg/mL) と DNase 皮質を孵化させなさい私は 37 ° C で 5 分間インキュベーションを生理食塩水で (0.25 mg/mL)12 皮質の推奨培養量は 5.4 mL、インキュベーション生理食塩水ストック トリプシン x 20 の 300 μ L 300 μ L 20 x の在庫 DNase の私。 3 皮質を洗って冷たい培養生理食塩水で x。 上澄みを除去し、めっき中の 2 mL はマイク在庫 DNase の 150 μ L で補足を追加します。未満 20 ストロークをピペッティングにより細胞を分離し、70 μ m の細孔径を持つセル ストレーナーを使用してセルをフィルターします。 メッキめっき中の 20 ml のセル ストレーナーを洗浄します。凍結細胞の在庫の準備のため洗浄を 20 mL 洗浄中のセル (材料の表を参照) 細胞カウンターとトリパン ブルー色素法を用いた幹細胞の密度を測定します。 1.4 倍の 105実行可能な細胞/ml メッキ媒体の密度に皮質細胞を希釈し、12 ウェル培養皿でペイ コート coverslips に希釈した細胞懸濁液の 1 mL を追加します。 2-3 日間の CO2インキュベーターで 37 ° C で細胞を維持し、維持培地を培養液に変更します。 1.4.9 のステップの後 3 分、スイングのローターを使用しての 187 x gで細胞を遠心分離によって冷凍皮質細胞の在庫を準備します。 上清を吸引し、凍結保存培地は 1 × 107セル/mL の細胞密度を得るため 4 ° C で保管 (材料の表を参照) を追加します。クライオ チューブに細胞懸濁液の分注 1 mL。 -80 ° C の温度に達するまでに凍結率-1 ° C/分でコンテナーを凍結細胞にチューブを置き、-80 ° C のフリーザー冷凍コンテナーに転送します。セルは-80 ° C で少なくとも 3 ヶ月間に保存できます。 凍結細胞を復活させる洗浄中 (各の極低温の管のおよそ 13 mL) と (材料表参照) 冷凍の大脳皮質細胞の培地を prewarm します。 37 の ° C の水浴中で急速に凍結細胞を解凍します。 Prewarmed 洗浄中で軽く解凍細胞を希釈します。187 x gスイング ローターを使って、3 分で細胞を遠心します。 洗浄中の 1 mL にペレットを中断し、実行可能な細胞密度を測定します。 3.0 x 10 の5実行可能なセル/mL、およびシード ペイ コート 12 ウェル プレートに細胞懸濁液の 1 mL の細胞密度をもたらす冷凍皮質細胞維持培地で細胞を希釈します。 2. 膜ターゲット GECIs の式 細胞のトランスフェクション 250 を追加 (すなわち、Lck GCaMP6f、Lck-RCaMP2、または CMV プロモーターと OER GCaMP6f) GECI プラスミドの ng 減少血清中の 100 μ L を7,8,9 (材料表参照) ウェルあたり。Lck RCaMP2 と OER-GCaMP6f、減少血清各ウェル中の 100 μ L のそれぞれのプラスミッドの使用 250 ng の失うかの。 トランスフェクション試薬の 0.5 μ L を追加 (材料表参照) プラスミッド減らされた血清媒体混合物によくあたり。Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f 失うか、0.5 μ L/ウェルのトランスフェクション試薬を追加します。 30 分間室温 (20-28 ° C) の混合物を孵化させなさい。 伝的に各 coverslip に 100 μ L の混合物を追加します。 CO2インキュベーター、GECIs の式を許可する 37 ° c で 48-72 時間細胞を孵化させなさい。 トランスフェクションと海馬や大脳皮質ニューロンのアデノ随伴ウイルス感染注:3-5 日間の in vitro トランスフェクション (DIV) 神経細胞のトランスフェクション率で起因します。6-8 DIV でトランスフェクションが GECIs のアストロ サイトでの最適な表現に適しています。9 DIV 後分散培養神経細胞における GECIs の発現、アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクター感染は優れた表現の有効性を提供します。Lck GCaMP6f、Lck-RCaMP2、OER-GCaMP6f プロモーターが前述のように準備された EF1a の下の表現のための AAV のベクトルは12を細胞 HEK293 を使用して (材料の表を参照してください)。 3-8 日めっき後の transfection のためラベル 2 管、プラスミド DNA と他のトランスフェクション試薬のための 1 つ。 減らされた血清中の 50 μ L を追加 (材料表参照) 各管にもあたり。 プラスミド DNA チューブにウェルあたり 0.5 μ g のプラスミド DNA coverslip あたりと (材料表参照) 神経細胞のトランスフェクション試薬を伴うサプリメントの 1 μ L を追加します。Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f 失うかの各プラスミドの 0.5 μ g とサプリメントの 1 μ L は、50 μ L/ウェル減少血清中ので混合されます。 トランスフェクション試薬の 1 μ L を追加 (材料表参照) トランスフェクション試薬の井戸あたり。トランスフェクション試薬の同じ量は、失うかに使用されます。 両方の渦管 1-2 s。 (ステップ 2.2.3) から DNA の混合物に (ステップ 2.2.4) からトランスフェクション試薬の混合物を追加します。軽くピペッティングして混合し、室温で 5 分間混合物 (coverslip あたり 100 μ L) を孵化させなさい。 伝の方法でセルにこの混合物をロードします。 CO2インキュベーター内のセル マーカー蛋白質を表現するまで 2-3 日間インキュベートします。 AAV 感染症混合ニューロン ・ グリア文化に AAV の 3 μ L/ウェルを追加します。皿をロッキングで優しく混ぜます。Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f のダブル感染症各 AAV の 3 μ L を導入するには、ウェルあたり.GECIs を発現する細胞数が十分ではない場合に感染症のため最適な AAV 量は決定する必要があります。 1-2 週間、GECIs が表現されるまでの文化を維持します。 3. Ca2 +イメージング Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f を発現する細胞の同時イメージング注:同時にレコード Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f 信号、画像分割光学系が必要です。光学系には、RCaMP2 と GCaMP6f の分離とカメラ (図 3 a) の同じ写真フレームの射影が有効にします。(1) 光源励起 (450-490 nm) の青色光を同時に出力できる必要があります同時イメージングも、顕微鏡の緑 (500-560 nm) スペクトル (2) ダブル バンド フィルター、ダイクロイック ミラーを設定し、RCaMP2 用フィルター (3) 排出量とGCaMP6f。詳細については、材料の表を参照してください。 イメージング デバイスと録音する前にコンピューターに少なくとも 30 分を入れます。37 ° c. に商工会議所を加熱顕微鏡を prewarm します。デバイスの画像分割、フィルター、および光源を設定します。カメラのビューの同じフィールドが表示されるように画像分割光学系を合わせます。適切な対物レンズを選択 (材料の表を参照してください)。 Lck RCaMP2 をトランスフェクトしたマウント セルを含む coverslip と録音室で OER GCaMP6f 室で、適切なイメージング媒体またはバッファー (18 mm coverslips に 400 μ L) を追加し、顕微鏡ステージ上に置きます。培地の蒸発を避けるためにレコーディング室に蓋を配置します。 蛍光イメージングによる Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f を発現している細胞を探します。退色、光毒性を防ぐために励起光強度を最小化します。 蓋を外し、10 Hz でコマ撮り録画を開始します。この録音中に Ca2 +応答 (例えば、COS 7 細胞の ATP HeLa 細胞のヒスタミン) を換起する商工会議所にアゴニストを追加します。 ハード ディスク ドライブ (HDD) の時間経過のデータを保存します。 画像解析ソフトを使用してデータを分析します。 Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f を表現するアストロ サイトの自発活動の記録注:画像分割光学系なし細胞膜と小胞体の周りで Ca2 +シグナルは同じセルで監視できます。ここでは、同じのアストロ サイトで Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f の逐次記録を説明しています。1.3 より大きい開口数と油浸対物は自発的 Ca2 +活動のため勧めします。 オンに、顕微鏡、カメラ、光源、および顕微鏡加熱室内楽録音する前に、少なくとも 30 分。 Lck RCaMP2 と録音室で OER GCaMP6f transfected セルを含む coverslip をマウントし、画像中の 400 μ L を追加します。商工会議所の上に蓋を置きます。 GCaMP6f と光源のフィルター セットを選択 (青色励起光、例えば 470– 490 nm;材料表を参照ください)。小田急電鉄 GCaMP6f を表現するアストロ サイトを探します。 RCaMP2 のフィルター セットと光源を選択 (例: 510-560 nm 励起光を緑;材料の表を参照してください)、Lck RCaMP2 が同じのアストロ サイトで表現されるかどうかを確認します。退色を防ぐために光源への長い露出を避けてください。 2 分の 2 Hz で Lck RCaMP2 のコマ撮り画像を記録は、HDD に画像データを保存します。 GCaMP6f に設定するフィルターを変更します。2 分の 2 Hz で、同じフィールドのビューで OER GCaMP6f のコマ撮り画像を記録は、HDD にデータを保存します。 画像解析ソフトを使用してデータを分析します。 ニューロンの自発神経活動と誘導 Ca2 +上昇を記録注:神経イメージングのための顕微鏡のセットアップは、セクション 3.2 で説明したのと同じです。ここでは、Lck GCaMP6f 時自発的 Ca2 +上昇と Ca2 +上昇により小田急電鉄 GCaMP6f mGluR 活性化によるイメージングを説明しています。 自発神経活動を記録するには、記録室で Lck GCaMP6f を発現している細胞を含む coverslip をマウントし、画像中の 400 μ L を追加します。商工会議所の上に蓋を置きます。 GCaMP6f のためのそれらにフィルターと光源 (青色励起、例えば 470-790 nm;材料の表を参照) を設定します。Lck GCaMP6f を表現し、自発的な活動を示すニューロンを見つけます。 2 hz またはより高速のイメージを取得します。HDD にデータを保存します。 画像解析ソフトを使用してデータを分析します。 誘導 Ca2 +上昇を記録するマウント coverslips 400 と OER GCaMP6f を発現している細胞を含む培地をイメージング μ L。商工会議所の上に蓋を置きます。 フィルターを使用して GCaMP6f の設定は、OER GCaMP6f を表現するニューロンを見つけます。 ふたを取り外します。2 hz またはより高速の時間経過の録音を開始します。記録中追加 Gq タンパク質共役受容体のアゴニスト (例えば、mGluR5 アゴニスト [の RS] – 3, 5 – dihydroxyphenylglycine [DHPG]) 小胞体からの Ca2 +放出を換起します。 HDD にコマ撮りの画像を保存し、データを分析します。