Рассечение местных Ca2 + сигналов в культивируемых клеток мембрана ориентированных Ca2 + индикаторы
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для Ca2 + изображений в нейронов и глиальных клеток, который позволяет рассечение Ca2 + сигналов на субклеточном резолюции. Этот процесс применяется для всех типов клеток, которые позволяют выражение генетически закодированный Ca2 + показателей.
Abstract
Ион кальция (Ca2 +) молекула универсальный внутриклеточным messenger диски несколько сигнальных путей, приводит к различных биологических материалов. Координация двух Ca2 + источников сигнала — «Ca2 + приток» из вне ячейки и «Ca2 + освобождение» от внутриклеточного Ca2 + хранить эндоплазменный ретикулум (ER) — считается лежат в основе различных пространственно временные закономерности Ca 2 + сигналы, которые вызывают несколько биологических функций в клетках. Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы описать новый Ca2 + изображения метод, который позволяет осуществлять мониторинг самого момента «Ca2 + приток» и «Ca2 + выпуск». ООР-GCaMP6f это генетически закодированный Ca2 + индикатор (ГЕЧИ) состоит из GCaMP6f, который предназначен для внешней мембраны ER. ООР-GCaMP6f может контролировать Ca2 + выпуска с более высоким временным разрешением чем обычных GCaMP6f. В сочетании с таргетингом на плазматической мембране GECIs, пространственно временной Ca2 + сигнал шаблон может быть описана в субцеллюлярные резолюции. Субцеллюлярные таргетингом Ca2 + индикаторы, описанные здесь в принципе, доступны для всех типов клеток, даже для в-vivo изображений Caenorhabditis elegans нейронов. В этом протоколе мы представляем Ca2 + изображения в ячейках от линий клеток, нейронов и глиальных клеток в диссоциированных первичных культур и описывают подготовку замороженных запас корковых нейронов крысы.
Introduction
CA2 + сигналы представляют собой повышение концентрации внутриклеточного Ca2 + . CA2 + является универсальной второй messenger для эукариотических клеток. С помощью Ca2 +, клетки функционировать через различных внутриклеточных сигнальных путей и побудить различных биологических материалов. Например в нейронах, релиз синаптических пузырьков на пресинаптическом терминале, экспрессии генов в ядро и индукции синаптической пластичности в postsynapse регулируются собственный Ca2 + сигналы, которые точно активировать соответствующий вниз по течению ферментов в правильные сайты и с точного времени1.
Определенных пространственно-временных закономерностей Ca2 + сигналов активировать специфических ферментов вниз по течению. CA2 + сигналы, генерируемые координацию между двумя различными Ca2 + источники: Ca2 + приток из внеклеточного пространства и Ca2 + освобождение от эндоплазменный ретикулум (ER), который служит в качестве внутриклеточного Ca2 + магазин. Значимые пространственно-временных Ca2 + сигнализации шаблон вызвать функцию определенную ячейку также поддерживается nanodomains 10 – 100 мкм Ca2 + созданных вблизи Ca2 + каналов на плазматической мембраны или ER мембраны2. Важно отметить, что источником Ca2 + сигналов является одним из наиболее важных факторов, определяющих течению биологической вывода. В нейронах Ca2 + приток и Ca2 + выпуска имеют противоположный эффект на кластеризации гамма – аминомасляная кислота (ГАМК)A рецепторов (ГАМКAR) на ГАМК синапсы, который отвечает за торможение 3возбудимости нейронов. CA2 + приток сопровождается массовым возбуждения нейронов индуцирует дисперсии синаптических ГАМКAR кластеров, тогда как постоянные Ca2 + освобождение от ER способствует кластеризации синаптических ГАМКARs. Другие группы также сообщил, что тюнинг направление конусы роста зависит от источника Ca2 + сигнала: Ca2 + приток вызывает отвращение, в то время как Ca2 + выпуск руководства притяжения нейрональных роста 4конус. Таким образом чтобы полностью понять Ca2 + сигнальные пути, лежащих в основе определенных клеточных выходов, важно определить источник Ca2 + сигналов, описывая Ca2 + сигналы на субклеточном резолюции.
В этом протоколе мы описываем Ca2 + изображения метод, позволяющий сообщить Ca2 + сигналы на субклеточном резолюции, которая позволяет оценки Ca2 + источников сигнала (рис. 1). CA2 + microdomains только под плазматической мембраны успешно контролируются генетически закодированный Ca2 + индикаторов (GECIs) ориентированы на плазматической мембране через вложение плазматической мембраны локализация сигнала Lck в Src Киназа N-Термини GECIs5. Чтобы обнаружить Ca2 + шаблон сигнала вблизи ER с лучше пространственным и временным разрешением, мы недавно разработали ООР-GCaMP6f, в котором GCaMP6f6 целей ER внешней мембраны, используя белка трансмембранного ER. ООР-GCaMP6f чутко могут сообщать Ca2 + освобождение от ER лучше пространственно-временных разрешением, чем обычные неадресных GCaMP6f в клетки COS-77 и HEK293 клетки8, избегая распространения Ca2 + и GECIs . Мы также подтвердили, что спонтанное Ca2 + высота в культивированный гиппокампа астроциты, сообщает ООР-GCaMP6f показало различных пространственно-временных шаблон по сравнению с наблюдением ориентированные на плазматической мембране GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, указав, что Ca2 + изображений с ООР-GCaMP6f в сочетании с Lck-GCaMP6f способствует рассечение Ca2 + сигналов на субклеточном резолюции для выявления их источников.
В настоящее время мы подробно протокол для Ca2 + сигнал вскрытия НеЬа клетки и нейрон экзоцитоз смешанных культур, покрытие на coverslips стекла. Ca2 + Тепловизионная техника с GECIs указано здесь, Lck-GCaMP6f, плазма мембраны ориентированных RCaMP210 (Lck-RCaMP2), и ООР-GCaMP6f (рис. 1), применимы ко всем ячейкам, в которые могут быть выражены эти GECIs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разнообразные биологические выходы инициируются Ca2 + сигналов. CA2 + является универсальным внутриклеточных сигнальных messenger. Декодирование Ca2 + сигналы вызывают конкретные мероприятия был фундаментальный вопрос биологического, и Ca2 + методы для описания многообразия Ca2 + сигналов визуализации не требуется. В настоящее время подробный протокол позволяет обнаружение собственный Ca2 + сигналов на плазматической мембраны и ER (рис. 3 и рис. 4) и местные Ca2 + microdomains в ячейку (рис. 4 и 5). Это способствует описания самых различных внутриклеточных Ca2 + сигналов. Временное разрешение Ca2 + сигналов, также была улучшена путем ориентации GECIs в плазматической мембраны и ER, потому что это может избежать эффекта трехмерного диффузии Ca2 + и GECIs себя, и она имеет потенциал, чтобы обнаружить момент Ca2 + приток или Ca2 + релиз, в котором происходит на мембране.
Протокол имеет некоторые ограничения. Пользователи должны иметь в виду, что обнаруженные сигналы являются суммирование «момент Ca2 + приток или освобождения» и «Ca2 + рассеянный от первоначального Ca2 + источника», особенно для больших Ca2 + сигналов. Например хотя его стимуляции клеток HeLa вызывает Ca2 + освобождение от ER, его результирующей Ca2 + сигналы обнаруживаются не только ER-целевой ООР-GCaMP6f, но и плазмы мембраны ориентированные Lck-RCaMP2 (рис. 3). Другое ограничение состоит, что пространственно-временных шаблон Ca2 + сигналов не может быть единственным определяющим фактором вывода Ca2 + сигналов. Распределение по течению эффекторных белков (например Ca2 +-зависимые киназы и фосфатаз) также может быть определяющим фактором2. Полностью расшифровать внутриклеточные сигналы Ca2 + , анализ поведения течению фермента, который не рассматривается в настоящем Протоколе, является абсолютно необходимым.
Одним из наиболее важных аспектов для успешного Ca2 + изображений является изображения установки и изображения приобретение условия, а также как другие исследования жить изображений. Ранее мы показали, что Ca2 + ответы в ячейке сильно зависит от продолжительности и интенсивности возбуждения и на условиях приобретения изображений, включая воздействия времени и приобретение частот16. Мощность освещения возбуждения является самым важным фактором, как это может вызвать токсическое воздействие света и Фотообесцвечивание GECIs. Запись условия время экспозиции, запись частоты, интенсивности света возбуждения и продолжительность записи должны быть оптимизированы согласно цели эксперимента. Мы рекомендуем сократить время экспозиции и возбуждения света, насколько это возможно избежать Фотообесцвечивание и фототоксичности на ячейку. Запись частоты и продолжительности записи должно быть достаточно для покрытия Ca2 + высота события, представляющие интерес, но должны храниться как низкий, как можно избежать Фотообесцвечивание и Фототоксичность также. Мы рекомендуем сначала определить запись частоты и продолжительности и оптимизации интенсивности света и времени экспозиции, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание GECIs. Еще одним важным фактором является уровень экспрессии GECIs. GECIs у Ca2 +-буферизация эффект, поскольку они Ca2 +-привязка белков. Таким образом гиперэкспрессия GECIs приводит к буферизации Ca2 +, который является физиологически необходимых для клеток. Чтобы избежать визуализации ячеек, выражая большое количество GECIs следует минимизировать количество ГЕЧИ выражения.
В заключение рассечение Ca2 + сигналов на субклеточном резолюции является одним из наиболее важных шагов для декодирования внутриклеточных Ca2 + сигналы, которые определяют биологические явления вывода. Этот протокол обеспечивает новый метод для рассечения Ca2 + сигналов для описания многообразия среди этих сигналов. В настоящее время этот метод ограничен для экспериментов в пробирке. Однако уже Lck-GCaMP6f используется для в-vivo Ca2 + изображений в мышей17, и ООР-GCaMP6f было подтверждено следить Ca2 + сигналов in vivo в VD двигательных нейронов в C. elegans7. Таким образом ориентация GECIs в отсеке субцеллюлярные имеет потенциал, чтобы расширить в естественных условиях изображений в будущем, таким образом благоприятные Ca2 + рассечение в естественных условиях.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается следующие гранты: Япония науки и техники Агентство (JST) / Precursory исследования эмбриональных науки и технологии (PRESTO) (JPMJPR15F8, Япония); Японское общество содействия развитию науки (JSP) / гранты в помощи для научных исследований (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Фонд Такэда. Авторы благодарят Haruhiko Бито (Университет Токио) за предоставление RCaMP2 и Артур Д.Ю Huang и Томас Макхью (RIKEN CBS) для предоставления векторы AAV и инструкции в отношении подготовки AAV. Авторы хотели бы также поблагодарить редакторов в журнал визуализировать эксперименты за их помощь с видео съемки и редактирования.
Materials
| (RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) | Tocris | #0342 | |
| 0.5% DNase I stock solution | Sigma-Aldrich | #11284932001 | Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30°C. |
| 0.5% Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | #25300054 | |
| 100 mM L-glutamine (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #25030081 | Preparing small aliquots of 250–750 µL and store at -30°C. |
| 100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #11360070 | Aliquots (10 mL) can be stored at -20°C. After thawing, the solution can be maintained at 4°C for 2 months. |
| 12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid | Falcon | #353043 | Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used. |
| 18-mm diameter circular coverslips | Karl Hecht "Assistent" | #41001118 | Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used. |
| 1M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2 – 7.6 |
| 2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) | Sigma-Aldrich | #T4674 | Prepare 150 µL aliquot and store at -30°C. |
| 50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution | Sigma-Aldrich | #P3143 | Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30°C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating. |
| 70% Ethanol | Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection. | ||
| Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter | AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request. | ||
| B-27 supplement (×50 stock) | Thermo Fisher Scientific | #17504044 | This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566). |
| B57BL/6 | Japan SLC, Inc. | ||
| Camera for microscopic image recording | The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) or CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0) | ||
| Cell freezing container | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | Alternative cell freezing container can be used. |
| Cell strainer | Falcon | #352350 | |
| CO2 incubator | Maintain at 37°C, 5% CO2. | ||
| Cryogenic tube | Corning | #430661 | Alternative cryogenic tubes can be used. |
| Cryopreservation medium | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
| Culture medium (for HeLa cells) | Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 µg/mL) | ||
| Dissection medium | One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM | ||
| DMEM | Nacalai | #08456-65 | Alternative DMEM can be used. |
| DMEM | Nacalai | #08456-65 | Low glucose |
| DNA transfection reagent | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used. |
| Glass jar with a lid | 500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal | ||
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | #14170161 | HBSS free of calcium and magnesium |
| Heat inactivated bovine serum | Thermo Fisher Scientific | #10100147 | |
| HeLa cells | RIKEN BioResource Center | #RCB0007 | |
| Histamine | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
| Image analysis software | Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made) | ||
| Image splitting optics | Hamamatsu Photonics | #A12801-01 | W-view GEMINI |
| Image splitting optics dichroic mirror | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein (GFP/RFP) signal |
| Image splitting optics emission filters | Semrock | #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 | For emission of GFP/RFP signal, respectively |
| Imaging medium and buffer | Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator. | ||
| Incubation saline | Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS | ||
| Inverted fluorescence microscope | Such as IX73 (Olympus) or Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
| Isoflurane | Pfizer | Used for anesthesia | |
| Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) | 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
| Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes) | 12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
| MEM (Minimum Essential Medium) | Thermo Fisher Scientific | #11090-081 | |
| Microscope filter set for GCaMP6f imaging | Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm) | ||
| Microscope filter set for RCaMP2 imaging | Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass) | ||
| Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging. |
| Microscope heating system | A heating system to maintain cells at 37°C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended. | ||
| Microscope light source for excitation | Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity. | ||
| Microscope objective lens | Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes. | ||
| Neurobasal plus medium | Thermo Fisher Scientific | #A3582901 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher Scientific | #10888022 | Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium. |
| PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+ | Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation | #164-23551 | The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used. |
| PC and image acquisition software | Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14. | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL |
| Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 | Available upon request | ||
| Plating medium (for 4 × 12 well dishes) | 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival. | ||
| Recording chamber | Elveflow | Ludin Chamber | This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips. |
| Reduced serum media | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
| Stereomicroscope | Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available. | ||
| Surgical instruments | Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains, 3 forceps with fine tips (Dumont Inox #5) | ||
| Transfection reagent for neuron | Thermo Fisher Scientific | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4. |
| Trypan blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
| Wash medium for frozen cortical cells | 25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin. | ||
| Wistar rats | Japan SLC, Inc | Pregnant rats (E18) |
References
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Bagur, R., Hajnoczky, G. Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling. Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).
- Bannai, H., et al. Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium. Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).
- Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering. Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Niwa, F., et al. Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).
- Vervliet, T., et al. Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux. Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).
- Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).
- Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).
- Quasthoff, K., et al. Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures. Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).
- Boehringer, R., et al. Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability. Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).
- Arizono, M., et al. Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation. Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).
- Kanemaru, K., et al. In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator. Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).
- Inoue, T. TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging. Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).
- Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
