JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Dissectie van lokale Ca2 + signalen in gekweekte cellen door membraan-gerichte Ca2 + indicatoren

Published: March 22, 2019
doi:
10.3791/59246
, , ,
1Japan Science and Technology Agency,PRESTO, 2Laboratory for Developmental Neurobiology,RIKEN Center for Brain Science, 3École Normale Supèrieure, Institut de Biologie de l’ENS (IBENS), Institut national de la santè et de la recherche mèdicale (INSERM), Centre national de la recherche scientifique (CNRS), École Normale Supèrieure, PSL Research University

Summary

Hier presenteren we een protocol voor Ca2 + imaging in zenuwcellen en gliacellen, waarmee de dissectie van Ca2 + signalen bij subcellular resolutie. Dit proces is van toepassing op alle celtypes waarmee de expressie van genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren.

Abstract

Calcium ion (Ca2 +) is een universele intracellulaire messenger molecule die meerdere signaalroutes drijft, wat leidt tot diverse biologische uitgangen. De coördinatie van twee Ca2 + signaalbronnen — “Ca2 + toestroom” van buiten de cel en “Ca2 + release” van de intracellulaire Ca2 + slaan endoplasmatisch reticulum (ER) — wordt beschouwd als grondslag van de uiteenlopende spatio-temporele patronen van Ca 2 + signalen die meerdere biologische functies in cellen leiden. Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een nieuwe Ca2 + beeldvorming methode waarmee het toezicht op het moment van “Ca2 + toestroom” en “Ca2 + release”. OER-GCaMP6f is een genetisch gecodeerde Ca2 + indicator (GECI) bestaande uit GCaMP6f, die aan de buitenmembraan ER wordt gericht. OER-GCaMP6f kunt controleren Ca2 + release op een hogere temporele resolutie dan conventionele GCaMP6f. In combinatie met plasmamembraan-gerichte GECIs, kan de spatio-temporele Ca2 + signaal patroon beschreven worden met een subcellular resolutie. De subcellular-gerichte Ca2 + indicatoren die hier worden beschreven zijn, in principe beschikbaar voor alle celtypes, zelfs voor de in vivo imaging van Caenorhabditis elegans neuronen. In dit protocol, we introduceren van Ca2 + imaging in cellen van cellijnen, zenuwcellen en gliacellen in gedissocieerde primaire culturen, en beschrijven van de voorbereiding van bevroren voorraad van rat corticale neuronen.

Introduction

CA2 + signalen vertegenwoordigen de verheffing van de intracellulaire Ca2 + concentratie. CA2 + is de universele second messenger voor eukaryotische cellen. Met behulp van Ca2 +, cellen functioneren via uiteenlopende intracellulaire signaalroutes en veroorzaken verschillende biologische uitgangen. Bijvoorbeeld, in neuronen, synaptic vesikel release op de presynaptische terminal, de expressie van genen in de celkern, en inductie van synaptische plasticiteit op de postsynapse worden geregeld door verschillende Ca2 + signalen die precies de juiste activeren stroomafwaarts enzymen op de juiste plaatsen en met precieze timing1.

Specifieke Spatio patronen van Ca2 + signalen activeren de specifieke downstream enzymen. CA2 + signalen worden gegenereerd door de coördinatie tussen twee verschillende Ca2 + bronnen: Ca2 + toestroom van de extracellulaire ruimte en Ca2 + vrijlating uit het endoplasmatisch reticulum (ER), die als een intracellulair Ca2 fungeert + opslaan. De zinvolle Spatio Ca2 + signalering patroon voor het opwekken van een bepaalde cel functie wordt ook ondersteund door nanodomains van 10-100 µM Ca2 + gegenereerd in de nabijheid van Ca2 + kanalen op het plasmamembraan of ER membraan2. Nog belangrijker is, is de bron van Ca2 + signalen een van de meest cruciale factoren bepalen de stroomafwaartse biologische output. Neuronen, Ca2 + toestroom en Ca2 + release tegenovergestelde effecten hebben op de clustering van gamma – aminoboterzuur (GABA)A -receptoren (GABAAR) op de GABAergic synapsen, die verantwoordelijk is voor de remming van neuronale prikkelbaarheid3. CA2 + toestroom vergezeld van massale neuronale excitatie induceert de spreiding van de synaptische GABAAR clusters, overwegende dat permanente Ca2 + die vrijkomt bij de ER bevordert de clustering van synaptic GABAARs. Andere groepen ook gemeld dat de tuning richting van groei kegels kritisch afhankelijk van de bron van de Ca2 + signaal is: Ca2 + toestroom induceert afkeer, terwijl Ca2 + release de aantrekkingskracht van de neuronale groei begeleidt kegel4. Daarom, om volledig te begrijpen de Ca2 + signalering trajecten die ten grondslag liggen aan de specifieke cellulaire uitgangen, het is belangrijk om te identificeren van de bron van Ca2 + signalen door te beschrijven van Ca2 + signalen op de subcellular resolutie.

In dit protocol beschrijven we een Ca2 + beeldvorming methode om te melden van Ca2 + signalen op de subcellular resolutie, waarmee de schatting van de Ca2 + signaalbronnen (Figuur 1). CA2 + microdomains net onder het plasmamembraan worden met succes gecontroleerd door genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren (GECIs) gericht op het plasma-membraan via de bijlage van het plasmamembraan-lokalisatie signaal Lck binnen Src kinase aan de N-termini GECIs5. Om te ontdekken de Ca2 + signaal patroon in de nabijheid van de ER bij een betere ruimtelijke en temporele resolutie, ontwikkeld wij onlangs OER-GCaMP6f, in welke GCaMP6f6 doelstellingen de ER buitenste membraan, met behulp van de ER transmembraan proteïne. OER-GCaMP6f kan gevoelig verslag Ca2 + vrijlating uit de ER bij een beter Spatio resolutie dan conventionele nontargeted GCaMP6f in COS-7 cellen7 en8van de cellen van HEK293, door het vermijden van de verspreiding van Ca2 + en GECIs . Wij ook bevestigd dat de spontane Ca2 + hoogte in gekweekte hippocampal astrocyten gerapporteerd door OER-GCaMP6f een ander Spatio patroon toonde ten opzichte van die gecontroleerd door plasmamembraan-gerichte GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, die aangeeft dat Ca2 + beeldbewerking met OER-GCaMP6f in combinatie met Lck-GCaMP6f bijdraagt tot de dissectie van Ca2 + signalen bij de subcellular resolutie om hun bronnen te identificeren.

Momenteel, detailleren wij het protocol voor de Ca2 + signaal dissectie in HeLa cellen en neuron-Astrocyt gemengde culturen verguld op glas coverslips. De Ca2 + beeldvormende techniek met GECIs aangegeven hier, Lck-GCaMP6f, plasma-membraan-gerichte RCaMP210 (Lck-RCaMP2), en OER-GCaMP6f (Figuur 1) zijn van toepassing op alle cellen die deze GECIs kunnen worden uitgedrukt.

Protocol

Alle hier beschreven experimenten werden goedgekeurd door het RIKEN veiligheidscommissie en dierlijke experiment Comité, volgens de richtlijn uitgegeven door het Japanse ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie. 1. bereiding van cellen Voorbereiding van poly (ethyleneimine)-gecoat coverslipsOpmerking: Poly(ethyleneimine) (PEI) coating wordt aanbevolen voor de glazen apparatuur, aangezien het toestaat neuronen en astrocyten hechten strak aan de coverslips zonder hun ontwikkeling voorkomen. Andere methoden van de coating (bijv. poly-ornithine, poly L-lysine, laminin coating) zijn echter ook beschikbaar, indien nodig, voor glazen-bodem gerechten. Plaats een 18 mm-diameter glas dekglaasje aan in elk putje van de plaat van een 12-well. Bereid 0,04% PEI oplossing (12,5 mL/12-well-plate) met behulp van gesteriliseerd water. Voeg 1 mL 0,04% PEI oplossing aan elk putje. Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen onder de coverslips. Incubeer de platen in een incubator CO2 ‘s nachts bij 37 ° C. De volgende dag wassen de gecoate coverslips 3 x met 1 mL van gesteriliseerd water. Verwijderen van de PEI-oplossing met een aspirator, voeg 1 mL gesteriliseerd water toe aan elk putje en schudden van de 12-well plaat zodat de PEI oplossing tussen het dekglaasje aan en de plaat kan grondig worden gewassen. Als de resterende PEI giftig voor de cellen is, ervoor zorgen dat het water na de laatste wasbeurt is volledig aanzuiging. Droog en steriliseren van de coverslips binnen de kap met ultraviolet (UV) licht gedurende ten minste 15 minuten. De PEI-gecoate schotel kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 2 maanden. Verlichting van de gerechten met UV-licht gedurende 15 minuten staan vlak voor gebruik. Voeg 5 mL steriel gedistilleerd water in de ruimte tussen de putten om te voorkomen dat de verdamping van het kweekmedium. Beplating cellijnenOpmerking: Dit protocol biedt slechts één voorbeeld voor Transfectie in cellen van zoogdieren cellijnen, zoals HeLa cellen en COS-7 cellen. Gebruikers kunnen toepassen op andere protocollen van de transfectie die zijn geoptimaliseerd voor hun experimenten. In deze sectie beschrijven we de HeLa cel cultuur protocol, dat ook voor cellen van COS-7 geldt. Cultuur op de dag vóór de transfectie, de cellen in een cultuur-schotel van 10 cm tot zij 70%-90% samenvloeiing bereiken. Prewarm het kweekmedium (Zie Tabel van materialen) tot 37 ° C. Wassen van de cellen 2 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + (PBS [-]). Gecombineerd van de PBS(-), voeg 1 mL 0,5% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing en Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 90 s totdat ze een ronde vorm bereiken. Voeg 9 mL kweekmedium voorverwarmde om te stoppen met de trypsinebehandeling. Verdun de cellen met gestolde voedingsbodem in een verhouding van 1:6. Zaad 1 mL van de verdunde cellen op PEI-gecoate coverslips in de 12-Wells-platen. Voorbereiding van hippocampal neuron-Astrocyt gemengde cultuur van ratten of muizenOpmerking: Secties 1.3 en 1.4 eerst moeten worden herzien en goedgekeurd door een dier zorginstellingen en gebruiken Commissie en moeten officieel goedgekeurde procedures volgen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Het stroomdiagram van het protocol van de neuronale cultuur is afgebeeld in Figuur 2. Alle reagentia onder de motorkap laminaire flow voor te bereiden. Plaats Dulbecco van gemodificeerde Eagle’s medium (DMEM) in twee 100 mm cultuur gerechten (ongeveer 20 mL/schotel) die in een koelbox. Bereiden van 50 mL van de dissectie medium samengesteld uit DMEM en 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) (Zie Tabel van materialen) en afzien van het medium in drie 60 mm cultuur gerechten (ongeveer 7 mL/schotel) en acht 35 mm cultuur gerechten (ongeveer 2 mL/schotel). Plaats de schotels in een ander koelbox. 50 mL de incubatie zoutoplossing, samengesteld uit Hanks evenwichtige zout oplossing aangevuld met 20 mM HEPES (Zie Tabel of Materials), bereiden en 8 mL van de zoutoplossing plaats in een conische tube van 15 mL op ijs. Het bereiden van het medium van de beplating met minimale essentiële medium (MEM) aangevuld met B-27, glutamine en penicilline-streptomycine (Zie Tabel van materialen). Het handhaven van dit medium bij kamertemperatuur (20-28 ° C). Het steriliseren van de chirurgische instrumenten met 70% ethanol. Plaats een papieren handdoek in een glazen pot met een deksel en 1 mL Isofluraan. Laat de Isofluraan verdampen voor 1 min. Plaats van een zwangere rat of een muis in de pot bereid volgens stap 1.3.6 en houden van het dier in de pot, totdat het is diep verdoofd (ongeveer 30 s tot 1 min). De narcose dier uit de pot nemen en ontsmetting van het dier en de dissectie-apparatuur door te spuiten ze met 70% ethanol. Snijd de ventral midline met standaard ontleden schaar en pincet en uitpakken van de baarmoeder van de zwangere rat of muis. Uittreksel E18-19 embryo’s uit de baarmoeder van een narcose vrouwelijke rat of muis, met behulp van delicate ontleden schaar, en plaats de uitgepakte embryo’s met een tang van een ring in ijskoude DMEM in een 10 cm schotel voor koude anesthesie. Decapitate het embryo met fijne dissectie schaar en plaats van het hoofd in ijskoude DMEM in een 10 cm schotel. Pak de hersenen uit elk embryo met een 13 cm gebogen Semken pincet en pincet met fijne tips. De hersenen houden in het ijskoude dissectie medium in een schotel van 60 mm. Verwijderen van de hippocampi, met behulp van twee pincet met fijne tips, in het ijskoude dissectie medium in 35 mm gerechten en onderhouden van het geïsoleerde weefsel in het incubatie-zoutoplossing geplaatst in een conische tube van 15 mL op ijs. Wassen van de hippocampi met incubatie zoutoplossing en incubeer met trypsine (1,25 mg/mL) en DNase ik (0,25 mg/mL) in de zoutoplossing incubatie gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Het aanbevolen incubatie volume is 2,7 mL van de incubatie saline, 150 µL van 20 x voorraad trypsine en 150 µL van 20 x voorraad DNase (Zie Tabel van materialen). Wassen van de hippocampi 3 x met ijskoude incubatie zoutoplossing. De incubatie saline gecombineerd en voeg 1 mL van het medium van de beplating met DNase ik (10 µL van stockoplossing; Zie Tabel van materialen). Opschorting van het weefsel door pipetting niet meer dan 20 x en meet de dichtheid van levensvatbare cellen, met behulp van een cel teller en Trypan blauwe assay. Verdun de hippocampal cellen met een dichtheid van 1.4 x 105 levensvatbare cellen/mL voor ratten en 2.5 x 105 levensvatbare cellen/mL voor muizen. 1 mL van de verdunde cel schorsingen op de PEI-gecoate coverslips in 12-well cultuur platen zaad. De cellen bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 2-3 dagen. Verwijder het medium van de beplating. Laat niet de cellen uitdrogen. Zacht en snel toevoegen het medium voorverwarmde onderhoud (Zie Tabel van materialen). Voorbereiding van rat corticale neuron-Astrocyt gemengde cultuur en bevroren cellen, en de heropleving van bevroren culturenOpmerking: Een cryopreservatie methode voor cellen van de corticale was beschreven previously11. Hier vindt u een gewijzigde protocol waarin corticale cellen kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C gedurende ten minste 3 maanden. Het stroomdiagram voor dit protocol is afgebeeld in Figuur 2. DMEM, dissectie medium, incubatie zoutoplossing en beplating medium zoals aangegeven in de stappen 1.3.1–1.3.4, en de Tabel van materialente bereiden. Bereiden van het medium van de wash bestaat uit DMEM, warmte-geïnactiveerd foetale runderserum en penicilline-streptomycine (Zie Tabel of Materials), indien nodig. Uittreksel E18-19 embryo’s uit de baarmoeder van een narcose vrouwelijke rat of muis, met behulp van delicate dissectie schaar, en ring pincet gebruiken elk uitgepakte embryo in ijskoude DMEM voor koude anesthesie plaatsen. Verwijderen van de hersenen van de embryo’s en houd ze in ijskoude dissectie medium. Verwijderen van de cortexes en handhaven in het incubatie-zoutoplossing geplaatst in een conische tube van 15 mL op ijs. Wassen van de cortexes met incubatie zoutoplossing en Incubeer de cortexes met trypsine (1,25 mg/mL) en DNase ik (0,25 mg/mL) in een zoutoplossing van de incubatie gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Het volume van de aanbevolen incubatie voor 12 cortexes is 5,4 mL van incubatie saline, 300 µL van 20 x voorraad trypsine en 300 µL van 20 x voorraad DNase ik. Wassen van de cortexes 3 x met ijskoude incubatie zoutoplossing. Verwijder het supernatant en voeg 2 mL van plating medium aangevuld met 150 µL van DNase ik voorraad. Distantiëren van de cellen door pipetteren van minder dan 20 lijnen, en de cellen met behulp van een zeef cel met een poriegrootte van 70 µm filteren. Wassen van de zeef van de cel met 20 mL van de beplating medium voor beplating. Voor de voorbereiding van bevroren cel voorraad, wassen de cellen met 20 mL van het wassen-medium (Zie Tabel van materialen) Meet de dichtheid van de levensvatbare cellen, met behulp van een cel teller en de blauwe Trypan-methode. Verdun de corticale cellen met een dichtheid van 1.4 x 105 levensvatbare cellen/mL met het medium van de beplating en voeg 1 mL van de verdunde celsuspensie aan PEI-gecoate coverslips in de 12-well cultuur platen. De cellen bij 37 ° C in een broedstoof CO2 gedurende 2-3 dagen en wijzig het kweekmedium aan het onderhoud medium. Na stap 1.4.9, bereiden de bevroren corticale cel voorraad door centrifugeren van de cellen bij 187 x g gedurende 3 min, met behulp van een schommel rotor. De bovendrijvende substantie gecombineerd en voeg het cryopreservatie medium (Zie Tabel van materialen) bewaard bij 4 ° C, tot het verkrijgen van een celdichtheid van 1 x 107 cellen/mL. Aliquot 1 mL van de celsuspensie in cryogene buizen. Plaats de buizen in een cel bevriezing container met een bevriezing snelheid van-1 ° C/min, totdat een temperatuur van-80 ° C is bereikt, en de bevriezing container overbrengen in een vriezer-80 ° C. De cellen kunnen worden opgeslagen gedurende ten minste 3 maanden bij-80 ° C. Prewarm om te blazen bevroren cellen, het wassen medium (ongeveer 13 mL voor elke cryogene buis) en onderhoud medium voor bevroren corticale cellen (Zie Tabel van materialen). Ontdooi de bevroren cellen snel bij 37 ° C in een waterbad. Verdun de ontdooide cellen zachtjes met voorverwarmde wassen medium. Centrifugeer de cellen bij 187 x g gedurende 3 min, met behulp van een schommel rotor. Suspendeer de pellet in 1 mL wassen voedingsbodem en meet de dichtheid van levensvatbare cellen. Verdun de cellen met het onderhoud medium voor bevroren corticale cellen een celdichtheid van 3.0 x 105 levensvatbare cellen/mL en 1 mL van de celsuspensie in de 12-well PEI-gecoate platen zaad opleveren. 2. weergave van de membraan-gerichte GECIs De transfectie van cellen Toevoegen van 250 ng van de GECI-plasmide (dat wil zeggen, Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 of OER-GCaMP6f met CMV promotor)7,8,9 aan 100 µL van het verminderde serum medium (Zie Tabel van materialen) per putje. Voor de cotransfection van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f, gebruik 250 ng van elke plasmide in 100 µL van verminderde serum medium in elk putje. Voeg 0,5 µL van transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) per putje in het plasmide verminderde serum middellange mengsel. Voor de cotransfection van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f, voeg toe 0,5 µL van transfectiereagens per putje. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (20-28 ° C). Voeg 100 µL van het mengsel aan elke dekglaasje aan op een drop-wise manier. Incubeer de cellen gedurende 48-72 uur in een CO2 incubator bij 37 ° C de expressie van de GECIs mogelijk te maken. Transfectie en adeno-associated virusinfectie van hippocampal of corticale neuronenOpmerking: Transfectie voor 3-5 dagen in vitro (DIV) resulteert in een hoger tarief van de transfectie voor neuronen. Transfectie op 6-8 DIV is de voorkeur voor de optimale expressie van GECIs in astrocyten. Voor de expressie van GECIs in gedissocieerde cultuur neuronen na 9 DIV biedt de infectie van de vectoren adeno-associated virus (AAV) een betere werkzaamheid van de expressie. AAV vectoren voor de expressie van Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f onder de EF1a initiatiefnemers werden voorbereid, zoals eerder is beschreven, met behulp van HEK29312 cellen (Zie Tabel van materialen). Voor Transfectie 3 – 8 dagen na de beplating, label twee buizen, één voor de plasmide DNA en de andere voor transfectiereagens. Voeg 50 µL van verminderde serum medium (Zie Tabel van materialen) per putje aan elke buis. Plasmide DNA per dekglaasje aan 0,5 µg en 1 µL van supplement vergezeld van transfectiereagens voor neuronen (Zie Tabel van materialen) per putje toevoegen aan de plasmide DNA buis. Voor de cotransfection van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f, 0,5 µg voor elke plasmide 1 µL van supplement Hangul als 50 µL van verminderde serum medium per putje. Voeg 1 µL van transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) per putje in de transfectie reagens buis. Dezelfde hoeveelheid transfectiereagens wordt gebruikt voor cotransfection. Vortex, beide buizen voor 1-2 s. Voeg het mengsel van de transfectie-reagens (uit stap 2.2.4) aan het mengsel van DNA (uit stap 2.2.3). Meng door zachtjes pipetteren en laat het mengsel (100 µL per dekglaasje aan) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Dit mengsel op de cellen in een drop-wise wijze laden. Incubeer de cellen in een incubator CO2 gedurende 2-3 dagen totdat de marker eiwitten worden uitgedrukt. Voeg 3 µL van AAV per putje aan de gemengde neuron-Astrocyt cultuur voor AAV infectie. Meng voorzichtig door het schommelen van de schotel. Voor de dubbele infectie van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f, wordt 3 µL van elke AAV ingevoerd per putje. In het geval dat de aantallen cellen uiten GECIs ontoereikend zijn, moet het bedrag van de optimale AAV voor infectie worden bepaald. De cultuur gedurende 1-2 weken totdat de GECIs worden uitgedrukt. 3. Ca2 + Imaging Gelijktijdige beeldvorming van cellen uiten Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6fOpmerking: Gelijktijdig opnemen de Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f signalen, beeld-splitsing optica zijn vereist. De optiek de scheiding tussen RCaMP2 en GCaMP6f en hun projectie op hetzelfde fotografische frame van de camera (figuur 3A) inschakelen. Gelijktijdige imaging ook vereist (1) lichtbronnen die gelijktijdig excitatie licht in het blauw (450 – 490 nm uitstoten kunnen) en groen (500-560 nm) spectra, (2) dubbel-band filter en dichroïde spiegel wordt ingesteld in de Microscoop, en (3) emissie filters voor RCaMP2 en GCaMP6f. Voor meer informatie, verwijzen naar de Tabel van materialen. Zet de imaging-apparaten en computers ten minste 30 minuten vóór de opname. Prewarm van de Microscoop verwarming kamer tot 37 ° C. Instellen van het apparaat Beeld splitsen, filters en lichtbron. Uitlijnen de optica Beeld splitsen zodat het hetzelfde gezichtsveld op de camera wordt weergegeven. Kiezen van het juiste objectief (Zie Tabel van materialen). Mount het dekglaasje aan met de cellen transfected met Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f in de zaal van de opname, voeg de passende imaging medium of buffer (400 µL voor 18 mm coverslips) in de kamer en plaats deze in het werkgebied van de Microscoop. Plaats een deksel op de opname zaal om te voorkomen dat de verdamping van het medium. De cellen uiten van zowel Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f door fluorescerende imaging zoeken. Minimaliseer de excitatie-lichtsterkte om te voorkomen dat photobleaching en fototoxiciteit. Verwijder het deksel en start van een time-lapse opname bij 10 Hz. Tijdens deze opname, voeg de agonist naar de vergaderzaal te roepen van Ca2 + Reacties (bijv. histamine voor HeLa cellen, ATP voor COS-7 cellen). De time-lapse gegevens opslaan in de harde schijf (HDD). Het analyseren van de gegevens met behulp van de software van de analyse van de afbeelding. Opname van de spontane activiteiten van astrocyten Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6fOpmerking: Zonder beeld-splitsing optica, kunnen de Ca2 + signalen op het plasma-membraan en de mensen rondom de ER in dezelfde cel worden gecontroleerd. Hier, wordt de sequentiële opnames van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f in de dezelfde astrocyten beschreven. Een olie-immersie objectief met een numerieke lensopening groter dan 1.3 is een aanrader voor spontane Ca2 + activiteit. Inschakelen van de Microscoop, camera, lichtbron, alsmede de Microscoop verwarming kamer minstens 30 min voordat u gaat opnemen. Mount het dekglaasje aan met de cellen transfected met Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f in de zaal van de opname en Voeg 400 µL van het imaging medium. Plaats een deksel op de top van de kamer. Kies de filter instellen voor GCaMP6f en de lichtbron (blauwe excitatie licht, bijvoorbeeld 470– 490 nm; Zie Tabel van materialen). Zoek de astrocyten uiting van OER-GCaMP6f. Kies een filter set en de lichtbron voor RCaMP2 (groene excitatie licht, bijvoorbeeld 510-560 nm; Zie Tabel van materialen) en bevestig of Lck-RCaMP2 wordt uitgedrukt in de dezelfde astrocyten. Vermijd lange blootstelling aan de lichtbron om te voorkomen dat photobleaching. Record time-lapse beelden van Lck-RCaMP2 met 2 Hz gedurende 2 minuten opslaan de beeldvorming gegevens op de harde schijf. Wijzig het filter ingesteld op die voor GCaMP6f. Record time-lapse beelden van OER-GCaMP6f in de zelfde gezichtsveld, bij 2 Hz gedurende 2 min. opslaan de gegevens op de harde schijf. Het analyseren van de gegevens met behulp van de software van de analyse van de afbeelding. Spontane Neuronale activiteit en geïnduceerde Ca2 + elevatie opname in neuronenOpmerking: De opstelling van de Microscoop voor neuronale imaging is hetzelfde als beschreven in punt 3.2. Hier, wordt de beeldvorming van spontane Ca2 + hoogte als gevolg van Lck-GCaMP6f en Ca2 + elevatie geïnduceerd door activatie van de mGluR als gevolg van de OER-GCaMP6f beschreven. Spontane Neuronale activiteit registreren, mount het dekglaasje aan met de cellen uiten Lck-GCaMP6f in de zaal van de opname en Voeg 400 µL van imaging medium. Plaats een deksel op de top van de kamer. Het filter en de lichtbron (blauwe excitatie, bijvoorbeeld 470-790 nm; Zie Tabel van materialen) die voor GCaMP6f instellen Vind de neuronen uiten Lck-GCaMP6f en tonen van de spontane activiteit. Verwerven van beelden met 2 Hz of sneller. Sla de gegevens op de harde schijf. Het analyseren van de gegevens met behulp van de software van de analyse van de afbeelding. Als u opnemen geïnduceerde Ca2 + hoogte, mount de coverslips met de cellen uiten van OER-GCaMP6f met 400 µL imaging medium. Plaats een deksel op de top van de kamer. Met het filter voor GCaMP6f instellen, vinden de neuronen uiten van OER-GCaMP6f. Verwijder het deksel. Start de time-lapse opname met 2 Hz of sneller. Tijdens de opname, het toevoegen van de agonisten voor een Gq-eiwit-gekoppelde receptor (bijvoorbeeld mGluR5 agonist [RS] – 3,5 – dihydroxyphenylglycine [DHPG]) om op te roepen een Ca2 + release van de ER. De time-lapse beelden op de harde schijf opslaan en analyseren van gegevens.

Representative Results

Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f werden uitgedrukt in HeLa cellen, en beide signalen werden geregistreerd gelijktijdig gebruik van beeld-splitsing optica, 24 uur na de transfectie (figuur 3A en Video 1). De beelden werden verworven bij 10 Hz. Histamine (zijn, 1 µM), die Ca2 + vrijlating uit de ER induceert, werd toegevoegd tijdens de opname. Op het verzoek van zijn de signaalsterkte van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f toegenomen, zoals blijkt uit de weergave van de kleurcorrectie van ΔF/F0, waarmee de verandering van de oorspronkelijke fluorescentie-intensiteit (figuur 3B). Het tijdsverloop van Ca2 + hoogte (ΔF/F0) gerapporteerd door Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f werden vergeleken in dezelfde regio van belang (ROI) (Figuur 3 c). De ΔF/F0 waarden zijn genormaliseerd naar hun piekwaarden om de tijd cursus vergelijking tussen de twee verschillende GECIs, die verschillende expressie niveaus en distributies hebben. Beide sensoren gemeld een trilling-achtige Ca2 + hoogte. Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f toonde het zelfde tijdsverloop voor Ca2 + hoogte in twee cellen onder de vijf celtypes onderzocht (Figuur 3 c, ROI 1 en 3). Ca2 + waterstand blijkt uit Lck-RCaMP2 bleef echter op een hoger niveau in vergelijking met het keuzemenu door OER-GCaMP6f (Figuur 3 C, ROI, 2, 4 en 5). De resultaten geven aan dat de Ca2 + hoogte in de nabijheid van het plasma-membraan, wordt verlengd, terwijl deze wordt beëindigd eerder rond de ER, dat is de bron van deze Ca2 + signaal geïnduceerd door zijn stimulatie. Spontane Ca2 + signalen van astrocyten in het neuron-Astrocyt gemengde cultuur van rat hippocampi (figuur 4A) en cortexes (figuur 4B) werden getoond door Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f (Figuur 4, Video 2, Video 3 , 4, en 5 Video). Corticale culturen werden nieuw leven ingeblazen uit de bevroren voorraad die opgesteld zoals beschreven in dit protocol. Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f signalen waren achtereenvolgens opgenomen met 2 Hz van dezelfde cellen. Drie ROIs werden geselecteerd in het gebied dat Ca2 + hoogte toonde door elke GECI, en de tijdsverloop van ΔF/Fbasis (dat wil zeggen, de intensiteit van de fluorescentie) veranderd van de intensiteit van de fluorescentie van gemiddelde gedurende de hele opname (Fbasis ). Wanneer de basislijn fluorescentie stabiel is en Ca2 + waterstand minder frequent zijn, wordt Fbasis een nuttige basislijn tot Ca2 + hoogte gebeurtenissen te detecteren. Spontane Ca2 + waterstand waren zichtbaar alleen tijdens het astrocytic proces, niet tijdens de cel lichaam. Dit resultaat komt overeen met de eerdere verslagen over astrocytic spontane Ca2 + signalen door andere GECIs gevisualiseerde in vitro13 en in vivo14. In zowel de hippocampal als de corticale astrocyten werden Ca2 + waterstand door Lck-RCaMP2 (boven) getoond vaker dan degenen die OER-GCaMP6f getoond. Dit resultaat is in overeenstemming met onze vorige demonstratie dat Ca2 + waterstand in astrocyten als gevolg van Lck-GCaMP6f vaker geconstateerd dan die als gevolg van de OER-GCaMP6f7 en stelt voor dat dit idee is ook van toepassing op de eencellige niveau. Spontane Ca2 + waterstand door Lck-GCaMP6f in onvolwassen rat hippocampal neuronen (10 DIV) werden gezien bij 2 Hz (figuur 5A en 6 van de Video). Het tijdsverloop van ΔF/F0 in vijf verschillende ROIs suggereren dat deze Ca2 + waterstand lokaal zijn beperkt tot de subcellular domeinen. Figuur 5B (Video 7) toont de Ca2 + antwoorden in volwassen muis hippocampal neuronen (30 DIV) geïnfecteerd met OER-GCaMP6f-expressie AAV vectoren. Neuronen werden met 100 µM DHPG, oftewel de agonist voor metabotropic glutamaat receptoren, inducerende Ca2 + release gestimuleerd. DHPG-geïnduceerde Ca2 + release als gevolg van de OER-GCaMP6f werd ontdekt. Figuur 1: Diagram met membraan-gerichte GECIs. Schematisch diagram van het plasmamembraan-gerichte GECIs (Lck-GCaMP6f en Lck-RCaMP2) en buitenste ER membraan-gerichte GCaMP6f (OER-GCaMP6f). Figuur 2: stroomdiagram voor hippocampal en corticale cel voorbereiding, plasmide transfectie en AAV infectie. De microscopische beelden zijn vertegenwoordiger, vers vergulde DIV-6 corticale cellen (links) en nieuw leven ingeblazen cellen uit de bevroren voorraad (rechts). Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: voorbeeld van de gelijktijdige beeldvorming van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f in HeLa cellen. (A) Schematische weergave van signaal scheiding met afbeelding-splitsing optica. Het hetzelfde gezichtsveld voor Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f wordt gelijktijdig geprojecteerd op de camera. Een representatieve opname verworven bij 10 Hz met een CMOS-camera in Video 1is gegeven, en één frame van deze opname wordt weergegeven in het deelvenster A (rechts). (B) pseudo-kleurenafbeeldingen van ΔF/F0 voor Lck-GCaMP2 (boven) en OER-GCaMP6f (onder). Histamine (zijn, 1 µM) toegevoegd op 0 s. (C) vertegenwoordiger genormaliseerde ΔF/F0 tijdsverloop van Lck-GCaMP2 (magenta) en OER-GCaMP6f (groen). Gegevens waren op de maximumwaarde van de ΔF/F0 voor ieder waarnemingspunt genormaliseerd. De grijze balken geven de timing van zijn aanvraag. Gegevens zijn geanalyseerd met een op maat gemaakte software TI Workbench15. Schaal bar = 50 µm (microscopische opname).  Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: Spontane Ca2 + hoogte in astrocyten gecontroleerd voor Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f expressie. De vertegenwoordiger van de (A) hippocampal en (B) corticale astrocyten transfected met Lck-RCaMP2 (boven) en OER-GCaMP6f (onder). Corticale cellen werden nieuw leven ingeblazen uit ingevroren voorraadculturen. Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f beelden werden opeenvolgend verworven in dezelfde cel, met 2 Hz, met een EM-CCD-camera. De percelen op de linker show het tijdsverloop van ΔF/Fbase in de ROIs gemeten aangegeven in de microscopische opname. Gegevens zijn geanalyseerd met TI Workbench. Werkelijke films vindt u in de Video 2, Video 3, Video 4en 5 van de Video. De schaal bar = 20 µm (microscopische opname). De basislijn drift suggereert de veranderingen in de mondiale Ca2 + niveau in de cel.  Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: Voorbeelden van Ca2 + imaging in neuronen met Lck-GCaMP6f en OER-GCaMP6f. (A) representatieve rat hippocampal neuronen uiten Lck-GCaMP6f op DIV 10 (links) en de percelen met de tijd die cursussen van ΔF/F0 gemeten in de ROIs (gele cirkels) hebben al aangegeven in de afbeelding (rechts). De getallen in de tijdsverloop komen overeen met de ROI-getallen in de afbeelding. Merk op dat de tijdelijke patroon van Ca2 + hoogte tussen de verschillende regio’s van belang verschilt. De basislijn drift suggereert de stijging van de mondiale Ca2 + niveau in deze neuron. (B) een voorbeeld van volwassen muis hippocampal neuronen (DIV 30) besmet met OER-GCaMP6f expressievectoren AAV (links). De tijd cursus perceel van ΔF/F0 gemeten de Ca2 + reactie op 100 µM toont (RS) – 3,5 – dihydroxyphenylglycine (DHPG) toegepast op de timing komt te staan door de grijze balk. Gele cirkels geven de positie van ROIs waar het tijdsverloop werd verkregen. De beelden waren verworven met 2 Hz met een gekoeld-CCD-camera (a-panel)of een EM-CCD-camera (deelvenster B) en geanalyseerd met TI Workbench. Schaal bar = 20 µm (microscopische opname). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Video 1: voorbeeld van gelijktijdige beeldvorming van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f in HeLa cellen. Representatieve opname verworven bij 10 Hz en gepresenteerd in Figuur 3. Schaal bar = 50 µm.  Klik hier om deze video te downloaden. Video 2: Spontane Ca2 + voorbijgaande waargenomen in Lck-RCaMP2 in hippocampal Astrocyt. Representatieve opname verworven met 2 Hz (figuur 4A), opgenomen in het zelfde gezichtsveld als Video 3. Schaal bar = 20 µm. Klik hier om deze video te downloaden. Video 3: Spontane Ca2 + voorbijgaande waargenomen in OER-GCaMP6f in een hippocampal Astrocyt. Representatieve opname verworven met 2 Hz (figuur 4A), in hetzelfde gezichtsveld van de als Video 2. Schaal bar = 20 µm. Klik hier om deze video te downloaden. Video 4: Spontane Ca2 + voorbijgaande waargenomen in Lck-RCaMP2 in een corticale Astrocyt vertegenwoordiger opname verworven met 2 Hz (figuur 4B), opgenomen in het zelfde gezichtsveld als Video 5. Schaal bar = 20 µm. Klik hier om deze video te downloaden. Video 5: Spontane Ca2 + voorbijgaande waargenomen in OER-GCaMP6f in een corticale Astrocyt. Representatieve opname verworven met 2 Hz (figuur 4B), in hetzelfde gezichtsveld van de als Video 4. De schaal bar = 20 µm. Klik hier om deze video te downloaden. Video 6: Voorbeeld van Ca2 + imaging in een rat hippocampal neuron (DIV 10) door Lck-GCaMP6f. Voorbeeld van neuronale Ca2 + signalen opgenomen met 2 Hz (figuur 5A). Schaal bar = 20 µm. Klik hier om deze video te downloaden. Video 7: Ca2 + versie in een muis hippocampal neuron (DIV 30) uiting van OER-GCaMP6f. Voorbeeld van neuronale Ca2 + signalen opgenomen in een muis hippocampal neuron besmet met OER-GCaMP6f AAV expressievectoren (figuur 5B). Het neuron werd gestimuleerd met 100 µM-dihydroxyphenylglycine (DHPG) toegepast op 30 s tot Ca2 + vrijlating uit de ER oproepen. Schaal bar = 20 µm. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussion

Diverse biologische uitgangen worden geïnitieerd door Ca2 + signalen. CA2 + is een veelzijdige intracellulaire signalering boodschapper. Decodering van Ca2 + signalen te roepen bepaalde uitgangen is een fundamentele biologische vraag, en Ca2 + beeldvormende technieken voor het beschrijven van de diversiteit van Ca2 + signalen zijn vereist. De momenteel gedetailleerde protocol mogelijk maakt het opsporen van verschillende Ca2 + signalen op het plasmamembraan en ER (Figuur 3 en 4 van de figuur) en lokale Ca2 + microdomains in een cel (Figuur 4 en Figuur 5). Dit draagt bij tot het beschrijven van de diversiteit van intracellulaire Ca2 + signalen. De temporele resolutie van Ca2 + signalen ook werd verbeterd door de doelgerichtheid van GECIs in het plasmamembraan en ER, omdat het voorkomen het effect van een driedimensionale verspreiding van de Ca2 + en GECIs zelf dat kan, en het heeft de potentie om op te sporen de zeer moment van Ca2 + toestroom of Ca2 + versie, die op het membraan optreedt.

Het protocol heeft wat beperkingen. Gebruikers moeten Houd er rekening mee dat de gedetecteerde signalen de sommatie van “the moment van Ca2 + toestroom of release zijn” en “Ca2 + verspreid uit vanaf de oorspronkelijke Ca2 + bron”, met name voor grote Ca2 + signalen. Bijvoorbeeld, hoewel zijn stimulering in HeLa cellen roept Ca vrijwaart2 + van de ER, de resulterende Ca2 + signalen worden ontdekt, niet alleen door ER-gerichte OER-GCaMP6f, maar ook door plasma-membraan-gerichte Lck-RCaMP2 (Figuur 3). Een andere beperking is dat het Spatio patroon van Ca2 + signalen kan niet de enige determinant van de output van Ca2 + signalen. De verdeling van de stroomafwaartse effector eiwitten (zoals Ca2 +-afhankelijke kinases en fosfatasen genaamd) kunnen ook een bepaling van de factor2. Als u wilt volledig decoderen de intracellulaire Ca2 + signalen, is analyse van downstream enzym gedrag, die niet is gedekt in dit protocol, absoluut noodzakelijk.

Een van de meest kritieke aspecten voor succesvolle Ca2 + beeldvorming is de beeldvorming setup en afbeelding overname voorwaarden, ook wat betreft andere live-imaging studies. Eerder toonden wij dat Ca2 + reacties in de cel sterk afhankelijk, zijn op de duur en intensiteit van excitatie en op afbeelding overname voorwaarden, met inbegrip van de blootstelling tijd en overname frequentie16. Excitatie verlichting kracht is de meest kritische factor, omdat het licht toxiciteit en photobleaching van GECIs kan veroorzaken. De opname-voorwaarden van belichtingstijd, opname frequentie, lage excitatie-intensiteit en duur van de opname moeten worden geoptimaliseerd volgens het doel van het experiment. Het is raadzaam om de vermindering van de blootstellingstijd en de excitatie lichtintensiteit zoveel mogelijk te vermijden photobleaching en fototoxiciteit naar de cel. De opname frequentie en de duur van de opname moeten voldoende zijn ter dekking van de Ca2 + hoogte gebeurtenissen van belang, maar moeten zo laag mogelijk te zijn en te vermijden photobleaching fototoxiciteit ook worden gehouden. Het is raadzaam om eerst bepalen van de opname frequentie en de duur en het optimaliseren van de lichtintensiteit en de blootstellingstijd zodat de photobleaching van de GECIs tot een minimum beperkt. Een andere belangrijke factor is het niveau van de expressie van de GECIs. GECIs hebben een Ca2 +-buffering effect zoals ze Ca2 zijn +-bindende eiwitten. De overexpressie van GECIs resulteert daarom in de buffer van Ca2 +, die fysiologisch noodzakelijk is voor de cellen. De hoeveelheid GECI expressie moet worden geminimaliseerd om te voorkomen dat beeldvorming cellen uiten van grote hoeveelheden GECIs.
 
Kortom, is de dissectie van Ca2 + signalen met een subcellular resolutie een van de belangrijkste stappen voor het decoderen van intracellulaire Ca2 + signalen die bepalend zijn voor de uitvoer biologisch verschijnsel. Dit protocol biedt een nieuwe methode voor de dissectie van Ca2 + signalen om te beschrijven de diversiteit onder deze signalen. Deze techniek is momenteel beperkt voor in vitro experimenten. Echter voor in vivo Ca2 + afbeeldingen in muizen17al Lck-GCaMP6f wordt gebruikt, en OER-GCaMP6f werd bevestigd voor het controleren van Ca2 + signalen in vivo in de VD motorische neuronen in C. elegans7. Daarom heeft gericht op GECIs in de subcellular compartiment het potentieel om te worden uitgebreid tot de in vivo imaging in de toekomst dus inschakelen Ca2 + dissectie in vivo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt ondersteund door de volgende rechten: het Japan Science and Technology Agency (BJS) / Precursory onderzoek voor embryonale wetenschap en technologie (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); de vereniging van Japan voor de bevordering van de wetenschap (JSPS) / verleent steun voor wetenschappelijk onderzoek (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Stichting van de Takeda. De auteurs bedanken Haruhiko Bito (Universiteit van Tokyo) voor het verstrekken van RCaMP2 en Arthur J.Y. Huang en Thomas McHugh (RIKEN CBS) voor het verstrekken van AAV vectoren en voor instructies met betrekking tot AAV voorbereiding. De auteurs ook bedank editors op de Journal of gevisualiseerd Experiments voor hun hulp bij de video filmen en bewerken.

Materials

(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) Tocris #0342
0.5% DNase I stock solution Sigma-Aldrich #11284932001 Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution  supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30°C.
0.5% Trypsin-EDTA solution Thermo Fisher Scientific #25300054
100 mM L-glutamine (×100 stock) Thermo Fisher Scientific #25030081 Preparing small aliquots of 250–750 µL and store at -30°C.
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) Thermo Fisher Scientific #11360070 Aliquots (10 mL) can be stored at -20°C. After thawing, the solution can be maintained at 4°C for 2 months.
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid Falcon #353043 Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.
18-mm diameter circular coverslips Karl Hecht "Assistent" #41001118 Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.
1M HEPES Thermo Fisher Scientific #15630080 pH 7.2 – 7.6
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) Sigma-Aldrich #T4674 Prepare 150 µL aliquot and store at -30°C.
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution  Sigma-Aldrich #P3143 Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30°C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.
70% Ethanol Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and  pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.
B-27 supplement (×50 stock) Thermo Fisher Scientific #17504044 This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).
B57BL/6 Japan SLC, Inc.
Camera for microscopic image recording The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,  ImagEM; Andor, iXon) or  CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Cell freezing container Sarstedt K.K. #95.64.253 Alternative cell freezing container can be used.
Cell strainer Falcon #352350
CO2 incubator Maintain at 37°C, 5% CO2.
Cryogenic tube Corning #430661 Alternative cryogenic tubes can be used.
Cryopreservation medium Zenoaq "CELLBANKER1"
Culture medium (for HeLa cells) Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 µg/mL)
Dissection medium  One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM 
DMEM Nacalai #08456-65 Alternative DMEM can be used.
DMEM Nacalai #08456-65 Low glucose
DNA transfection reagent Sigma-Aldrich #6366244001 "X-tremegene HP DNA transfection reagent"
Alternative transfection reagents can be used.
Glass jar with a lid 500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal 
HBSS Thermo Fisher Scientific #14170161 HBSS free of calcium and magnesium
Heat inactivated bovine serum Thermo Fisher Scientific #10100147
HeLa cells RIKEN BioResource Center #RCB0007
Histamine Sigma-Aldrich #H7125
Image analysis software Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made) 
Image splitting optics Hamamatsu Photonics #A12801-01 W-view GEMINI
Image splitting optics dichroic mirror Semrock #FF560-FDi01-25×36 For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein  (GFP/RFP) signal
Image splitting optics emission filters Semrock #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 For emission of GFP/RFP signal, respectively
Imaging medium and buffer Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.
Incubation saline  Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS
Inverted fluorescence microscope Such as IX73 (Olympus) or  Eclipse TI (Nikon Instech)
Isoflurane Pfizer Used for anesthesia
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution.
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes)  12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution.
MEM (Minimum Essential Medium) Thermo Fisher Scientific #11090-081
Microscope filter set for GCaMP6f imaging Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm)
Microscope filter set for RCaMP2 imaging Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass)
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f Semrock #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.
Microscope heating system A heating system to maintain cells at 37°C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.
Microscope light source for excitation Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.
Microscope objective lens Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.
Neurobasal plus medium Thermo Fisher Scientific #A3582901
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher Scientific #10888022 Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+  Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation #164-23551 The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.
PC and image acquisition software Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.
Penicillin-Streptomycin solution Thermo Fisher Scientific #15140122 Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL 
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 Available upon request
Plating medium (for 4 × 12 well dishes) 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of  the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.
Recording chamber Elveflow Ludin Chamber This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.
Reduced serum media Thermo Fisher #11058021 Opti-MEM
Stereomicroscope Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.
Surgical instruments Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,  3 forceps with fine tips  (Dumont Inox #5)
Transfection reagent for neuron Thermo Fisher Scientific #L3000008 "Lipofectamine 3000" reagent.
It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4.
Trypan blue (0.4%) Thermo Fisher Scientific #15250061
Wash medium for frozen cortical cells  25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin.
Wistar rats Japan SLC, Inc Pregnant rats (E18)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  2. Bagur, R., Hajnoczky, G. Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling. Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).
  3. Bannai, H., et al. Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium. Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).
  4. Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering. Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).
  5. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).
  6. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  7. Niwa, F., et al. Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).
  8. Vervliet, T., et al. Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux. Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).
  9. Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).
  10. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).
  11. Quasthoff, K., et al. Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures. Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).
  12. Boehringer, R., et al. Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability. Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).
  13. Arizono, M., et al. Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation. Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).
  14. Kanemaru, K., et al. In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator. Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).
  15. Inoue, T. TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging. Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).
  16. Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).
  17. Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).

Tags

Ca2+ SignalsCalcium ImagingGenetically Encoded Calcium IndicatorsSubcellular ResolutionCalcium InfluxCalcium ReleaseCell CulturePEI CoatingCell DissociationCortexTrypsinDNasePlating Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bannai, H., Hirose, M., Niwa, F., Mikoshiba, K. Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (145), e59246, doi:10.3791/59246 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image