Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon
Summary
Burada bir iletişim kuralı için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca2 + düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.
Abstract
Kalsiyum iyon (Ca2 +) birden çok sinyal yolları, çeşitli biyolojik çıkışlar için önde gelen sürücüler bir evrensel hücre içi haberci moleküldür. İki Ca2 + sinyal kaynağı koordinasyonu — “Ca2 + akını” dan hücre dışında ve “Ca2 + sürümü” hücre içi Ca2 + endoplazmik retikulum (ER) — farklı spatio-temporal desenleri Ca’nın altında yatan kabul edilir birden çok biyolojik fonksiyonları hücrelerde neden 2 + sinyalleri. Bu iletişim kuralının amacı “Ca2 + akını” ve “yayın Ca2 +” çok anda izleme sağlayan yeni bir Ca2 + görüntüleme yöntemi tarif etmektir. OER-GCaMP6f ER dış membran için hedef GCaMP6f oluşan bir genetik olarak kodlanmış Ca2 + (GECI) göstergesidir. OER-GCaMP6f Ca2 + yayın geleneksel GCaMP6f daha yüksek zamansal çözünürlükte izleyebilirsiniz. Plazma zarı hedefli Turk ile birlikte, kendisinin zamansal Ca2 + sinyal örneği hücre altı çözünürlükte tanımlanabilir. Burada açıklanan hücre altı hedefli Ca2 + göstergeleri prensip olarak, tüm hücre türleri için kullanılabilir bile içinde vivo için Caenorhabditis elegans nöronlar Imaging. Bu iletişim kuralı ‘ Ca2 + görüntüleme hücrelerde hücre satırlarından, sinir hücreleri ve Disosiye birincil kültürlerde gliyal hücreler tanıtmak ve sıçan kortikal nöronların donmuş stok hazırlanması açıklayın.
Introduction
CA2 + sinyalleri intrasellüler Ca2 + konsantrasyonunun yükselmesi temsil eder. CA2 + ökaryotik hücreler için evrensel ikinci messenger’dır. CA2 +kullanarak, hücreleri farklı hücre içi sinyal yolları çalışır ve çeşitli biyolojik çıkışlarını ikna etmek. Örneğin, nöronlar, sinaptik vezikül yayın presynaptic terminalinde içinde gen ekspresyonu çekirdeği ve postsynapse, sinaptik plastisite indüksiyon düzenlenir, tam olarak uygun etkinleştiren ayrı Ca2 + sinyalleri tarafından aşağı akım enzimler doğru sitelerdeki ve hassas zamanlama1.
Ca2 + sinyallerin belirli kronolojik zamanmekansal desenleri belirli aşağı akım enzimleri aktif hale getirin. CA2 + sinyalleri iki farklı Ca2 + kaynakları arasında koordinasyon tarafından oluşturulur: Ca2 + akını ekstrasellüler boşluk ve Ca2 + sürümü bir intrasellüler Ca2 + hizmet veren endoplazmik retikulum (ER), saklayın. Belirli hücre işlevi ikna etmek için anlamlı kronolojik zamanmekansal Ca2 + sinyal desen Ca2 + kanal plazma zarı veya ER membran2çevresinde oluşturulan 10-100 µM Ca2 + nanodomains tarafından da desteklenir. Önemlisi, Ca2 + sinyalleri aşağı akım biyolojik çıkış belirleyen en önemli faktörlerden biri kaynağıdır. Nöronlarda, Ca2 + akını ve Ca2 + yayın gama – aminobütirikasit (GABA)A reseptörleri (GABAAR) GABAergic sinapslar, kümeleme üzerinde ters etkileri inhibisyonu için sorumlu olduğu vardır nöronal uyarılabilirlik3. Tarafından büyük nöronal uyarma eşliğinde Ca2 + akını sinaptik GABAAR kümeleri dağılım neden olmaktadır, kalıcı Ca2 + yayın ise acil servis sinaptik GABAARs kümeleme teşvik etmektedir. Diğer gruplar da büyüme koniler ayarlama yönünü eleştirel Ca2 + sinyal kaynağında bağlı olduğunu bildirdin: Ca2 + akını indükler itme, Ca2 + yayın cazibe nöronal büyüme yol gösterir iken koni4. Bu nedenle, tamamen belirli hücresel çıkışlarını temel yolları sinyal Ca2 + anlamak için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte açıklayarak Ca2 + sinyal kaynağını tanımlamak önemlidir.
Bu protokol için Ca2 + sinyalleri Ca2 + sinyal kaynakları (şekil 1) tahmini sağlar hücre altı çözünürlükte bildirmek için bir Ca2 + görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. CA2 + microdomains plazma zarı altında başarıyla plazma zarı-yerelleştirme sinyal Lck Src içinde eki ile plazma zarı hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri (Turk) tarafından izlenir kinaz Turk5N termini için. Ca2 + sinyal örneği bir daha iyi kayma ve zamansal çözünürlük acil civarında algılamak için biz son zamanlarda OER-GCaMP6f, GCaMP6f hangi6 hedefler acil servis dış membran içinde ER transmembran protein kullanılarak geliştirilmiş. OER-GCaMP6f hassas Ca2 + ve Turk Difüzyon kaçınarak Ca2 + çözünürlükte daha iyi kronolojik zamanmekansal COS-7 hücreleri7 ve HEK293 hücreleri8, geleneksel nontargeted GCaMP6f ER yayınlamasını bildirebilirsiniz . Biz de spontan Ca2 + yükseklik OER-GCaMP6f tarafından bildirilen kültürlü Hipokampal astrocytes farklı bir kronolojik zamanmekansal desen gösterdi doğruladı plazma zarı hedefli GCaMP6f tarafından izlenen ile karşılaştırıldığında (Lck-GCaMP6f)7 ,9OER-GCaMP6f ile Ca2 + görüntülemede Lck-GCaMP6f ile birlikte Ca2 + sinyalleri kaynaklarını tanımlamak için hücre altı çözünürlükte diseksiyon katkıda gösteren,.
Halen, protokol Ca2 + sinyal diseksiyon HeLa hücreleri ve nöron-astrocyte cam coverslips üzerinde kaplama kültürler karışık için ayrıntı. Ca2 + görüntüleme tekniği ile Turk burada, Lck-GCaMP6f, plazma membran hedeflenmiş RCaMP210 (Lck-RCaMP2), belirtilen ve bu Turk belirtilebilir tüm hücrelere OER-GCaMP6f (şekil 1) tabidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farklı biyolojik çıkışlarını Ca2 + sinyalleri tarafından başlatılır. CA2 + çok yönlü bir hücre içi sinyal messenger’dır. Belirli çıkışlarını uyandırmak için Ca2 + sinyalleri şifresini çözmek bir temel biyolojik soru olmuştur ve Ca2 + sinyalleri çeşitliliği açıklamak için Ca2 + görüntüleme teknikleri gereklidir. Şu anda detaylı Protokolü ayrı Ca2 + sinyalleri plazma zarı ve ER (şekil 3 ve şekil 4) ve yerel Ca2 + microdomains (şekil 4 ve şekil 5) hücre içinde algılanmasını sağlar. Bu hücre içi Ca2 + sinyalleri çeşitliliği açıklayan için katkıda bulunur. Ca2 + zamansal çözünürlük sinyallerini ayrıca geliştirilmiş Turk plazma zarı ve ER Ca2 + ve Turk kendilerini üç boyutlu bir Difüzyon etkisini önleyebilirsiniz ve tespit potansiyeline sahiptir çünkü hedefleyerek Ca2 + akını veya membran üzerinde oluşan Ca2 + açıklaması, çok anda.
Protokol bazı sınırlamalar vardır. Kullanıcılar algılanan sinyalleri “Ca2 + akın ya da serbest bırakmak an” toplamı olduğunu göz önünde tutmalı ve “Ca2 + dışarı orijinal Ca2 + kaynaktan, büyük Ca2 + sinyalleri için özellikle yayılmış”. Örneğin, her ne kadar onun stimülasyon HeLa hücrelerin çağrıştıran Ca2 + serbest üzerinden ER, onun sonuç Ca2 + sinyalleri sadece ER hedefli OER-GCaMP6f tarafından aynı zamanda plazma membran hedeflenmiş Lck-RCaMP2 (şekil 3) tarafından algılanır. Ca2 + sinyalleri kronolojik zamanmekansal desen Ca2 + sinyal çıktısını tek belirleyici olabilir başka bir kısıtlamadır. Aşağı akım efektör proteinler dağılımı (gibi Ca2 +-bağımlı kinaz ve fosfatazlar) bir belirleyici faktör2de kullanabilirsiniz. Tamamen intrasellüler Ca2 + sinyalleri şifresini çözmek için bu protokol için kapsamına girmeyen, akış aşağı enzim davranış analizi kesinlikle gereklidir.
Başarılı Ca2 + görüntüleme için en önemli unsurlarından biri görüntüleme ayarı ve görüntü edinme koşulları, de diğer canlı görüntüleme çalışmaları gelince. Biz daha önce Ca2 + hücre yanıtlarında süresi ve yoğunluğu uyarma ve görüntü edinme koşulları, pozlama süresi ve satın alma sıklığı16dahil olmak üzere son derece bağımlı olduğunu gösterdi. Uyarma aydınlatma güç en kritik faktör olduğu hafif toksisite ve Turk photobleaching neden olabilir. Pozlama süresi, sıklığı, uyarma ışık şiddeti ve süresi kayıt, kayıt kayıt şartları deneme amaçlı göre optimize edilmelidir. Çekim hızı ve uyarma ışık şiddeti photobleaching ve hücreye fototoksisite önlemek mümkün olduğunca azaltılması tavsiye ediyoruz. Kayıt sıklığı ve süresi, kayıt Ca2 + yükseklik ilgi etkinlikleri karşılamak için yeterli olmalı ama aynı zamanda photobleaching ve fototoksisite önlemek mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır. Biz kayıt sıklığı ve süresi önce belirleyerek ve Turk photobleaching simge durumuna küçültülmüş ışık yoğunluğunu ve çekim hızı optimize öneririz. Bir başka önemli faktör Turk ifade düzeyidir. Turk var bir Ca2 +-Ca2 +olduğu gibi etkisi arabelleğe alma-proteinler bağlama. Bu nedenle, Turk overexpression Ca2 +, fizyolojik hücreler için gerekli olan tampon içinde sonuçlanır. GECI ifade miktarını görüntüleme hücreleri Turk yüksek miktarda ifade önlemek için indirilmelidir.
Sonuç olarak, Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon çıkış biyolojik fenomen belirleyen intrasellüler Ca2 + sinyalleri şifresini çözmek için en önemli adımlardan biridir. Bu iletişim kuralı bu sinyalleri arasında çeşitlilik açıklamak için Ca2 + sinyalleri diseksiyon için yeni bir yöntem sağlar. Şu anda, bu teknik içinde vitro deneyler için sınırlıdır. Ancak, Lck-GCaMP6f içinde vivo Ca2 + görüntülemede fareler17için kullanılmakta olan ve OER-GCaMP6f Ca2 + izlemek için C. elegans7 VD motor nöronlarda ın vivo sinyalleri onaylandı. Bu nedenle, Turk hücre altı yerde hedefleme içinde vivo gelecekte, böylece etkinleştirme Ca2 + diseksiyon içinde vivo Imaging’e genişletilecek potansiyeline sahiptir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser aşağıdaki hibe tarafından desteklenir: Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (JST) / Precursory araştırma embriyonik bilim ve Teknoloji (saygınlık) (JPMJPR15F8, Japonya); Japonya toplum bilim (JSP’ler) tanıtımı için / Takeda Vakfı bilimsel araştırma (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), yardım verir. Yazarlar Haruhiko Bito (Tokyo Üniversitesi) RCaMP2 ve Arthur J.Y. Huang verdiğiniz için teşekkür ederiz ve Thomas McHugh (RIKEN CBS) AAV vektörel çizimler sağlamak için ve talimatlar için AAV hazırlık ile ilgili. Yazarlar ayrıca editörler günlük, görselleştirildiği deneyler için video filme ve düzenleme ile onların yardım etmek, teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| (RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) | Tocris | #0342 | |
| 0.5% DNase I stock solution | Sigma-Aldrich | #11284932001 | Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30°C. |
| 0.5% Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | #25300054 | |
| 100 mM L-glutamine (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #25030081 | Preparing small aliquots of 250–750 µL and store at -30°C. |
| 100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #11360070 | Aliquots (10 mL) can be stored at -20°C. After thawing, the solution can be maintained at 4°C for 2 months. |
| 12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid | Falcon | #353043 | Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used. |
| 18-mm diameter circular coverslips | Karl Hecht "Assistent" | #41001118 | Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used. |
| 1M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2 – 7.6 |
| 2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) | Sigma-Aldrich | #T4674 | Prepare 150 µL aliquot and store at -30°C. |
| 50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution | Sigma-Aldrich | #P3143 | Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30°C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating. |
| 70% Ethanol | Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection. | ||
| Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter | AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request. | ||
| B-27 supplement (×50 stock) | Thermo Fisher Scientific | #17504044 | This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566). |
| B57BL/6 | Japan SLC, Inc. | ||
| Camera for microscopic image recording | The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) or CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0) | ||
| Cell freezing container | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | Alternative cell freezing container can be used. |
| Cell strainer | Falcon | #352350 | |
| CO2 incubator | Maintain at 37°C, 5% CO2. | ||
| Cryogenic tube | Corning | #430661 | Alternative cryogenic tubes can be used. |
| Cryopreservation medium | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
| Culture medium (for HeLa cells) | Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 µg/mL) | ||
| Dissection medium | One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM | ||
| DMEM | Nacalai | #08456-65 | Alternative DMEM can be used. |
| DMEM | Nacalai | #08456-65 | Low glucose |
| DNA transfection reagent | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used. |
| Glass jar with a lid | 500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal | ||
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | #14170161 | HBSS free of calcium and magnesium |
| Heat inactivated bovine serum | Thermo Fisher Scientific | #10100147 | |
| HeLa cells | RIKEN BioResource Center | #RCB0007 | |
| Histamine | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
| Image analysis software | Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made) | ||
| Image splitting optics | Hamamatsu Photonics | #A12801-01 | W-view GEMINI |
| Image splitting optics dichroic mirror | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein (GFP/RFP) signal |
| Image splitting optics emission filters | Semrock | #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 | For emission of GFP/RFP signal, respectively |
| Imaging medium and buffer | Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator. | ||
| Incubation saline | Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS | ||
| Inverted fluorescence microscope | Such as IX73 (Olympus) or Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
| Isoflurane | Pfizer | Used for anesthesia | |
| Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) | 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
| Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes) | 12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
| MEM (Minimum Essential Medium) | Thermo Fisher Scientific | #11090-081 | |
| Microscope filter set for GCaMP6f imaging | Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm) | ||
| Microscope filter set for RCaMP2 imaging | Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass) | ||
| Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging. |
| Microscope heating system | A heating system to maintain cells at 37°C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended. | ||
| Microscope light source for excitation | Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity. | ||
| Microscope objective lens | Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes. | ||
| Neurobasal plus medium | Thermo Fisher Scientific | #A3582901 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher Scientific | #10888022 | Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium. |
| PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+ | Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation | #164-23551 | The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used. |
| PC and image acquisition software | Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14. | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL |
| Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 | Available upon request | ||
| Plating medium (for 4 × 12 well dishes) | 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival. | ||
| Recording chamber | Elveflow | Ludin Chamber | This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips. |
| Reduced serum media | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
| Stereomicroscope | Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available. | ||
| Surgical instruments | Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains, 3 forceps with fine tips (Dumont Inox #5) | ||
| Transfection reagent for neuron | Thermo Fisher Scientific | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4. |
| Trypan blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
| Wash medium for frozen cortical cells | 25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin. | ||
| Wistar rats | Japan SLC, Inc | Pregnant rats (E18) |
References
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Bagur, R., Hajnoczky, G. Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling. Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).
- Bannai, H., et al. Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium. Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).
- Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering. Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Niwa, F., et al. Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).
- Vervliet, T., et al. Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux. Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).
- Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).
- Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).
- Quasthoff, K., et al. Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures. Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).
- Boehringer, R., et al. Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability. Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).
- Arizono, M., et al. Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation. Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).
- Kanemaru, K., et al. In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator. Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).
- Inoue, T. TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging. Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).
- Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
