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Neuroscience

Dissection des signaux locaux Ca2 + dans les cellules cultivées par axés sur la Membrane Ca2 + indicateurs

Published: March 22, 2019
doi:
10.3791/59246
, , ,
1Japan Science and Technology Agency,PRESTO, 2Laboratory for Developmental Neurobiology,RIKEN Center for Brain Science, 3École Normale Supèrieure, Institut de Biologie de l’ENS (IBENS), Institut national de la santè et de la recherche mèdicale (INSERM), Centre national de la recherche scientifique (CNRS), École Normale Supèrieure, PSL Research University

Summary

Nous présentons ici un protocole pour Ca2 + l’imagerie dans les neurones et les cellules gliales, qui permet la dissection de Ca2 + signaux à résolution subcellulaire. Ce processus s’applique à tous les types de cellules qui permettent l’expression des indicateurs génétiquement codés de Ca2 + .

Abstract

Les ions calcium (Ca2 +) sont une molécule universelle messager intracellulaire qui entraîne de multiples voies de signalisation, menant à divers produits biologiques. La coordination des deux sources de Ca2 + signal — « Ca2 + afflux » d’à l’extérieur de la cellule et « Libération2 + Ca » du Ca2 + intracellulaire stocker réticulum endoplasmique (re) — est considérée comme sous-tendent les divers patrons spatio-temporelle de Ca 2 + signaux qui causent plusieurs fonctions biologiques dans les cellules. Ce protocole vise à décrire une nouvelle Ca2 + méthode d’imagerie qui permet la surveillance des moment de « Influx de Ca2 + » et « Ca2 + release ». OER-GCaMP6f est un codé génétiquement Ca2 + indicateur (GECI) comprenant GCaMP6f, qui vise à la membrane externe de l’ER. OER-GCaMP6f peut surveiller la libération de Ca2 + à une résolution temporelle supérieure à GCaMP6f conventionnel. Combiné avec GECIs axés sur la membrane plasmique, le spatio-temporelle Ca2 + signal modèle peut être décrit à une résolution subcellulaire. Subcellulaire ciblés Ca2 + indicateurs décrits ici sont, en principe, disponible pour tous les types de cellules, même pour l’in vivo d’imagerie des neurones Caenorhabditis elegans . Dans ce protocole, nous présenter Ca2 + imagerie dans les cellules des lignées de cellules, neurones et cellules gliales dans les cultures primaires dissociés et décrire la préparation congelée stock de neurones corticaux de rat.

Introduction

Ca2 + signaux représentent l’élévation de la concentration intracellulaire de Ca2 + . Ca2 + est le second messager universel pour les cellules eucaryotes. À l’aide de Ca2 +, les cellules fonctionnent par l’intermédiaire de diverses voies de signalisation intracellulaire et induisent divers produits biologiques. Par exemple, dans les neurones, la libération des vésicules synaptiques dans la terminaison présynaptique, expression de gène dans le noyau et l’induction de la plasticité synaptique à la postsynapse sont réglementés par distinctes Ca2 + des signaux qui justement activer le cas échéant enzymes en aval sur les sites de droite et avec le timing précis1.

Des modèles spécifiques spatio-temporelle des signaux de Ca2 + activent les enzymes spécifiques en aval. Ca2 + signaux sont générés par la coordination entre les deux Ca2 + sources différentes : influx de Ca2 + de l’espace extracellulaire et la libération de Ca2 + du réticulum endoplasmique (ER), qui sert une Ca intracellulaire2 + magasin. La significative spatio-temporelle Ca2 + signalisation modèle pour induire une fonction de cellule spécifique est également pris en charge par nanodomains de 10 à 100 µM Ca2 + générée dans les environs de Ca2 + canaux sur la membrane plasmique ou ER membrane2. Ce qui est important, la source des signaux de Ca2 + est l’un des plus importants facteurs qui déterminent la production biologique en aval. Dans les neurones, l’influx de Ca2 + et2 + libération de Ca ont des effets opposés sur le regroupement des récepteurs de l’acide gamma – aminobutyrique (GABA)A (GABAAR) dans les synapses GABAergiques, qui est responsable de l’inhibition de la 3de l’excitabilité neuronale. Influx de ca2 + accompagné d’excitation neuronale massive provoque la dispersion des grappes de GABAAR synaptiques, tandis que persistent Ca2 + la libération de l’ER favorise le regroupement des synaptique GABAARs. Autres groupes ont également rapporté que la direction de syntonisation des cônes de croissance est critique dépend de la source du signal2 + Ca : influx de Ca2 + provoque la répulsion, alors que la libération de Ca2 + guides l’attraction de la croissance neuronale cône4. Par conséquent, pour bien comprendre le Ca2 + qui sous-tendent les sorties cellulaires spécifiques de voies de signalisation, il est important d’identifier la source des signaux de Ca2 + en décrivant les signaux de Ca2 + à la résolution subcellulaire.

Dans ce protocole, nous décrivons une Ca2 + méthode d’imagerie pour signaler les signaux de Ca2 + à la résolution subcellulaire, qui permet l’estimation du Ca2 + sources de signaux (Figure 1). Ca2 + microdomaines juste en dessous de la membrane plasmique sont contrôlés avec succès par génétiquement encodé Ca2 + indicateurs (GECIs) destinés à la membrane plasmique par l’intermédiaire de la fixation du signal membrane plasmique-localisation Lck dans Src kinase pour les extrémités N-terminales de GECIs5. Pour détecter le profil des signaux Ca2 + à proximité de la salle d’urgence à une meilleure résolution spatiale et temporelle, nous avons développé récemment rela-GCaMP6f, dans laquelle membrane externe de cibles l’ER GCaMP6f6 , utilisant la protéine transmembranaire ER. OER-GCaMP6f peut signaler avec délicatesse de Ca2 + sortie de la salle d’urgence à une meilleure résolution spatio-temporelle à classiques GCaMP6f non ciblées au COS-7 cellules7 et de cellules HEK2938, en évitant la diffusion de Ca2 + et GECIs . Nous a également confirmé que l’élévation de Ca2 + spontanée dans les astrocytes cultivés hippocampe rapporté par rel-GCaMP6f a montré une tendance spatio-temporelle différente par rapport à celle contrôlée par GCaMP6f axés sur la membrane plasmique (Lck-GCaMP6f)7 ,9, ce qui indique que Ca2 + imagerie avec REL-GCaMP6f en combinaison avec Lck-GCaMP6f contribue à la dissection des signaux de Ca2 + à la résolution subcellulaire d’indiquer leurs sources.

Actuellement, nous détaillons le protocole de la dissection dans les cellules HeLa et neuron-astrocyte plaqués sur couvre-objet en verre de cultures mixé de Ca2 + signal. La Ca2 + technique d’imagerie avec GECIs indiquées ici, Lck-GCaMP6f, plasma membrane ciblées RCaMP210 (Lck-RCaMP2), et rel-GCaMP6f (Figure 1) sont applicables à toutes les cellules dans lesquelles ces GECIs peuvent être exprimées.

Protocol

Toutes les expériences décrites ici ont été approuvées par la Commission de sécurité du RIKEN et expérimentation animale, conformément aux lignes directrices émises par le ministère japonais de l’éducation, la Culture, Sports, Science et technologie. 1. préparation des cellules Préparation de poly (ethylèneimine)-enduit des lamelles couvre-objetRemarque : Revêtement poly(ethyleneimine) (PEI) est recommandé pour les appareils de verre, car elle permet les neurones et les astrocytes pour fixer solidement sur les lamelles sans entraver leur développement. Toutefois, autres méthodes de revêtement (poly-ornithine, poly, L-lysine, laminine revêtement) sont également disponibles, si nécessaire, pour des plats de fond en verre. Placez une lamelle de verre de 18 mm de diamètre dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. Préparer la solution de PEI de 0,04 % (12,5 mL/12-puit plaque) à l’aide d’eau stérilisée. Ajouter 1 mL de solution de PEI de 0,04 % à chaque puits. S’assurer qu’il n’y a pas de bulles sous le couvre-objet. Incuber les boîtes dans un incubateur à CO2 pendant une nuit à 37 ° C. Le lendemain, laver les lamelles enduit 3 x 1 ml d’eau stérilisée. Enlever la solution de PEI avec dispositif d’aspiration, ajouter 1 mL d’eau stérilisée à chaque puits et secouer la plaque de 12 puits afin que la solution de PEI entre la lamelle et la plaque peut être rincée soigneusement. Le PEI restant étant toxique pour les cellules, s’assurer que l’eau après que le lavage final est complètement aspiré. Sécher et stériliser les lamelles à l’intérieur de la hotte avec ultraviolets (UV) pendant au moins 15 minutes. Le plat enduit de PEI peut être stocké à 4 ° C pendant 2 mois. Éclairer les plats avec ultraviolets pendant 15 min juste avant utilisation. Ajouter 5 mL d’eau distillée stérile dans l’espace entre les puits pour éviter l’évaporation de la milieu de culture. Lignées cellulaires d’électrodépositionRemarque : Ce protocole prévoit qu’un seul exemple transfection dans les cellules des lignées cellulaires de mammifères, tels que les cellules HeLa et cellules COS-7. Les utilisateurs peuvent appliquer d’autres protocoles de transfection qui sont optimisées pour leurs expériences. Dans cette section, nous allons décrire le protocole de culture de cellules HeLa, qui est également applicable aux cellules COS-7. La veille de la transfection, la culture des cellules dans une boîte de Petri de 10 cm jusqu’à ce qu’ils atteignent la confluence de 70 à 90 %. Préchauffer le milieu de culture (voir Table des matières) à 37 ° C. Laver les cellules 2 x avec tampon phosphate salin sans Ca2 + et Mg2 + (PBS [-]). Aspirer la PBS(-), ajouter 1 mL de solution à 0,5 % trypsine-tétraacétique (EDTA) d’acide et incuber les cellules à 37 ° C pendant 90 s jusqu’à ce qu’ils atteignent une forme ronde. Ajouter 9 mL de milieu de culture préchauffée à arrêter la trypsinisation. Diluer les cellules avec milieu de culture à un ratio de 1:6. 1 mL de cellules dilués de PEI-enduit de lamelles dans les plaques de 12 puits de graines. Préparation de la culture de hippocampe neuron-astrocyte mélangé des rats ou des sourisRemarque : Sections 1.3 et 1.4 doivent d’abord être examinés et approuvé par une animalerie institutionnels et utiliser et doivent suivre des procédures agréées officiellement pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. L’organigramme du protocole culture neuronale est illustré à la Figure 2. Préparer tous les réactifs sous la hotte à flux laminaire. De place Dulbecco mis à jour le milieu Eagle (DMEM) dans deux 100 mm culture plats (environ 20 mL/plat) qui se trouvent dans une glacière. Préparer 50 mL de milieu dissection composé de DMEM et 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES) (voir la Table des matières) et répartir le milieu dans trois boîtes de culture de 60 mm (environ 7 mL/plat) et huit 35 mm Petri (environ 2 mL/plat). Placer les capsules dans une glacière. Préparation de 50 mL de la solution saline d’incubation, composée de solution saline équilibrée de Hanks additionnée de 20 mM HEPES (voir Table des matières) et placer 8 mL de la solution saline dans un tube conique 15 mL sur la glace. Préparer le milieu de placage avec milieu essentiel minimum (MEM) additionné de B-27, de glutamine et la pénicilline-streptomycine (voir Table des matières). Maintenir ce milieu à température ambiante (20 à 28 ° C). Stériliser les instruments chirurgicaux, éthanol à 70 %. Placer une serviette en papier dans un bocal en verre avec un couvercle et 1 mL d’isoflurane. Laisser l’isoflurane évaporer pendant 1 min. Placez une enceinte rat ou une souris dans le bocal, établi selon l’étape 1.3.6 et garder l’animal dans le bocal jusqu’à ce qu’il est profondément anesthésié (environ 30 s à 1 min). Sortez le bocal de l’animal anesthésié et désinfecter l’animal ainsi que le matériel de dissection en vaporisant d’éthanol à 70 %. Couper la ligne ventrale médiane avec pinces et ciseaux de dissection standard et extraire de l’utérus de l’enceinte rat ou la souris. E18 – 19 embryons extrait de l’utérus d’un rat femelle anesthésié ou souris, à l’aide de ciseaux de dissection délicate et placer les embryons extraites avec une pince anneau DMEM glacé dans un plat de 10 cm pour l’anesthésiologie en froid. Décapiter l’embryon avec des ciseaux de dissection fine et placez la tête en DMEM glacé dans un plat de 10 cm. Le cerveau extrait chaque embryon avec un 13 cm courbé Semken pinces et pinces avec des pointes fines. Garder le cerveau dans le milieu de dissection glacé dans un plat de 60 mm. Retirez l’hippocampe, avec des pointes fines, dans le milieu de dissection glacée dans les plats de 35 mm à l’aide de deux pinces et maintenir les tissus isolés dans la saline d’incubation placée dans un tube conique 15 mL sur la glace. Laver l’hippocampe avec du sérum physiologique d’incubation et incuber avec la trypsine (1,25 mg/mL) et de la DNase I (0,25 mg/mL) dans une solution saline l’incubation pendant 5 min à 37 ° C. Le volume recommandé d’incubation est de 2,7 mL de la solution saline d’incubation, 150 µL de 20 x stock trypsine et 150 µL de stock de x 20 DNase (voir Table des matières). Laver l’hippocampe 3 x avec une solution saline glacée d’incubation. Aspirer la solution saline d’incubation et ajouter 1 mL de milieu électrodéposition contenant la DNase I (10 µL de la solution mère ; voir Table des matières). Suspendre le tissu par pipetage sans toutefois dépasser 20 x et mesurer la densité de cellules viables, à l’aide d’un compteur de cellules et le bleu Trypan dosage. Diluer les cellules hippocampiques à une densité de 1,4 x 105 viable cellules/mL pour les rats et 2,5 x 105 viables cellules/mL pour les souris. 1 mL des suspensions de cellules dilué sur les lamelles de PEI-enduit en plaques de 12 puits de culture des graines. Maintenir les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 pendant 2 à 3 jours. Retirez le support de placage. Ne laissez pas les cellules dessécher. Doucement et rapidement ajouter le support de maintenance préchauffée (voir Table des matières). Préparation du rat neuron-astrocyte corticale mélangé culture cellules congelées et la renaissance des cultures congeléesRemarque : Un procédé de cryoconservation de cellules corticales a été décrit previously11. Ici, un protocole modifié dans lequel les cellules corticales peuvent être stockées à-80 ° C pendant au moins 3 mois est fourni. L’organigramme de ce protocole est illustré à la Figure 2. Préparer DMEM, moyen de dissection, saline d’incubation et médium placage comme indiqué dans les étapes 1.3.1–1.3.4 et la Table des matières. Préparer le milieu de lavage constitué de DMEM, sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur et la pénicilline-streptomycine (voir Table des matières), si nécessaire. E18 – 19 embryons extrait de l’utérus d’un rat femelle anesthésié ou souris, à l’aide de ciseaux de dissection délicate et utilisez la pince anneau d’y pour placer chaque embryon extrait DMEM glacée pour l’anesthésiologie en froid. Retirer le cerveau de l’embryon et conservez-les dans un milieu glacé de dissection. Retirez le cortex et leur maintien dans la saline d’incubation placée dans un tube conique 15 mL sur la glace. Laver le cortex avec du sérum physiologique d’incubation et incuber le cortex avec la trypsine (1,25 mg/mL) et de la DNase I (0,25 mg/mL) dans une solution saline de l’incubation pendant 5 min à 37 ° C. Le volume d’incubation recommandée pour 12 cortex est 5,4 mL de sérum physiologique d’incubation, 300 µL de 20 x stock trypsine et 300 µL de stock de x 20 DNase I. Laver le cortex 3 x avec une solution saline glacée d’incubation. Retirez le surnageant et ajouter 2 mL de milieu de placage complétée avec 150 µL de DNase I stock. Dissocier les cellules en pipettant également, moins de 20 coups et filtrer les cellules à l’aide d’une passoire à cellule avec une taille de pore de 70 µm. Lavez le tamis cellulaire avec 20 mL de milieu placage pour le placage. Pour la préparation du stock de cellules congelées, laver les cellules avec 20 mL de milieu lavage (voir Table des matières) Mesurer la densité des cellules viables, à l’aide d’un compteur de cellules et la méthode bleu Trypan. Diluer les cellules corticales à une densité de 1,4 x 105 viables cellules/mL avec le milieu de l’électrodéposition et ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dilué à PEI-enduit de lamelles dans les plaques de 12 puits de culture. Maintenir les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 pendant 2 à 3 jours et changer le milieu de culture dans le milieu de l’entretien. Après l’étape 1.4.9, préparer le stock de cellules corticales congelés en CENTRIFUGEANT les cellules à 187 x g pendant 3 min, à l’aide d’un rotor de swing. Aspirer le surnageant et ajouter le support de cryoconservation (voir Table des matières) conservés à 4 ° C, pour obtenir une densité de 1 x 107 cellules/mL. Aliquote 1 mL de la suspension cellulaire dans des tubes cryogéniques. Placer les tubes dans une cellule de congélation contenant avec un taux de congélation de-1 ° C/min, jusqu’à obtention d’une température de-80 ° C et transférer le conteneur congélation dans un congélateur à-80 ° C. Les cellules peuvent être conservés pendant au moins 3 mois à-80 ° C. Pour raviver les cellules congelées, préchauffer la lavage moyen (environ 13 mL pour chaque tube cryogénique) et support de maintenance pour des cellules corticales congelées (voir Table des matières). Décongeler les cellules congelées rapidement à 37 ° C dans un bain d’eau. Diluer les cellules dégelées doucement avec milieu de lavage préchauffée. Centrifuger les cellules à 187 x g pendant 3 min, à l’aide d’un rotor de swing. Suspendre le culot dans 1 mL de milieu de lavage et de mesurer la densité de cellules viables. Diluer les cellules avec le support de maintenance pour des cellules corticales congelés obtenir une densité de 3,0 x 105 cellules viables/mL et semences 1 mL de la suspension cellulaire dans les plaques de 12 puits PEI-enduit. 2. expression de GECIs axés sur la Membrane Transfection des cellules Ajouter 250 ng de plasmide GECI (Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 ou rela-GCaMP6f avec le promoteur de CMV)7,8,9 à 100 µL de milieu sérum réduit (voir le Tableau des matériaux) / puits. Pour la cotransfection Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f, emploi 250 ng de chaque plasmide dans 100 µL de milieu de sérum réduit dans chaque puits. Ajouter 0,5 µL de réactif de transfection (voir Table des matières) / puits dans le mélange moyen de sérum réduit de plasmide. Pour la cotransfection Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f, ajouter 0,5 µL de réactif de transfection par puits. Incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante (20 à 28 ° C). Ajouter 100 µL du mélange dans chaque lamelle de manière goutte-à-goutte. Incuber les cellules pendant 48 à 72 h dans un incubateur à CO2 à 37 ° C, afin de permettre l’expression des GECIs. La transfection et l’infection par le virus adeno-associé de neurones hippocampal ou corticalesRemarque : Transfection pour 3 à 5 jours in vitro (DIV) se traduit par un taux plus élevé de transfection pour les neurones. Transfection à 6 – 8 DIV est préférée pour l’expression optimale de GECIs dans les astrocytes. Pour l’expression de GECIs dans les neurones dissociées de la culture après 9 DIV, l’infection des vecteurs adeno-associated virus (AAV) fournit une meilleure efficacité de l’expression. Des vecteurs d’AAV pour l’expression de Lck-GCaMP6f, RCaMP2-Lck et rel-GCaMP6f sous la EF1a promoteurs ont été préparés comme décrit précédemment, à l’aide de HEK293 cellules12 (voir Table des matières). Pour la transfection 3 à 8 jours après l’ensemencement, marquer deux tubes, un pour l’ADN plasmidique et l’autre pour le réactif de transfection. Ajouter 50 µL de milieu de sérum réduit (voir le Tableau des matériaux) / puits dans chaque tube. Ajouter 0,5 µg d’ADN par lamelle plasmidique et 1 µL de supplément accompagné de réactif de transfection pour les neurones (voir Table des matières) / puits dans le tube d’ADN de plasmide. Pour la cotransfection Lck-RCaMP2 et GCaMP6f-rel, 0,5 µg de chaque plasmide et 1 µL de supplément sont mélangés dans 50 µL de milieu de sérum réduit par puits. Ajouter 1 µL de réactif de transfection (voir Table des matières) / puits dans le tube de réactif de transfection. La même quantité de réactif de transfection est utilisée pour l’analyse. Vortex les deux tubes pour 1 à 2 s. Ajouter le mélange réactif de transfection (de l’étape 2.2.4) pour le mélange de l’ADN (de l’étape 2.2.3). Mélanger en pipettant également doucement et incuber le mélange (100 µL par lamelle) pendant 5 min à température ambiante. Charger ce mélange sur les cellules d’une manière goutte-à-goutte. Incuber les cellules dans un incubateur à CO2 pendant 2 à 3 jours jusqu’à ce que le marqueur de protéines est exprimées. Pour l’infection de l’AAV, ajouter 3 µL de VAA / puits dans la culture mixte neuron-astrocyte. Mélanger doucement en balançant le plat. Pour la double infection de Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f, 3 µL de chaque AAV est introduit par puits. Dans le cas où le nombre de cellules exprimant GECIs n’est pas, déterminer la quantité optimale d’AAV pour infection. Maintenir la culture pendant 1 à 2 semaines jusqu’à ce que les GECIs sont exprimés. 3. Ca2 + imagerie Imagerie simultanée des cellules exprimant Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6fRemarque : D’enregistrer simultanément les signaux Lck-RCaMP2 et GCaMP6f-rel, partage d’image optique sont nécessaires. Les optiques permettent la séparation entre RCaMP2 et GCaMP6f et leur projection sur la même image photographique de la caméra (Figure 3 a). Aussi l’imagerie simultanée nécessite des sources de (1) lumière qui peuvent émettre simultanément d’excitation lumineuse dans le bleu (450 à 490 nm) et les spectres de vert (500 à 560 nm), filtre (2) double-bande et miroir dichroïque définit dans le microscope et d’émission (3) filtres pour RCaMP2 et GCaMP6f. Pour plus d’informations, reportez-vous à la Table des matières. Allumez les appareils d’imagerie et les ordinateurs au moins 30 min avant l’enregistrement. Préchauffer le microscope chauffage chambre à 37 ° C. Mettre en place le dispositif de partage d’image, filtres et source de lumière. Aligner le partage d’image optique pour que le même champ de vision s’affiche sur l’appareil photo. Choisir l’objectif approprié (voir la Table des matières). Montage de la lamelle couvre-objet contenant les cellules transfectées avec Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f dans la chambre d’enregistrement, ajouter le support d’imagerie approprié ou tampon (400 µL pour 18 mm lamelles couvre-objet) dans la chambre et placez-le sur la platine du microscope. Placez un couvercle sur la chambre d’enregistrement pour éviter l’évaporation du milieu. Localiser les cellules exprimant les Lck-RCaMP2 et les rela-GCaMP6f par imagerie de fluorescence. Réduire l’intensité lumineuse de l’excitation pour empêcher le Photoblanchiment et phototoxicité. Retirez le couvercle et démarrer un enregistrement time-lapse à 10 Hz. Au cours de cet enregistrement, ajoutez l’agoniste à la chambre pour évoquer des réponses Ca2 + (p. ex., l’histamine pour les cellules HeLa, ATP des cellules COS-7). Sauvegarder les données time-lapse dans le disque dur (HDD). Analyser les données à l’aide de logiciels d’analyse image. Enregistrement des activités spontanées des astrocytes exprimant Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6fRemarque : Sans partage d’image optique, les signaux de Ca2 + à la membrane plasmique et ceux autour de la salle d’urgence peuvent être contrôlés dans la même cellule. Ici, nous décrivons l’enregistrement séquentiel de Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f dans les astrocytes mêmes. Un objectif immersion dans l’huile avec une ouverture numérique plus grande que 1.3 est fortement recommandé pour l’activité spontanée de Ca2 + . Allumez le microscope, caméra, éclairage et le chauffage de microscope chamber au moins 30 min avant l’enregistrement. Monter la lamelle contenant les cellules transfectées avec Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f dans la chambre d’enregistrement et ajouter 400 µL de milieu d’imagerie. Placez un couvercle sur le dessus de la chambre. Choisissez le filtre pour GCaMP6f et la source lumineuse (lumière d’excitation, p. ex. 470– 490 bleue nm ; voir Table des matières). Localiser les astrocytes exprimant OER-GCaMP6f. Choisissez un ensemble filtre et la source de lumière pour RCaMP2 (vert lumière d’excitation, p. ex., 510 – 560 nm ; voir Table des matières) et confirmer si Lck-RCaMP2 est exprimée dans les astrocytes mêmes. Évitez la longue exposition à la source de lumière afin d’éviter le Photoblanchiment. Enregistrer des images time-lapse de Lck-RCaMP2 à 2 Hz pendant 2 min. sauvegarder les données d’imagerie sur le disque dur. Changer le filtre que la valeur pour GCaMP6f. Enregistrer des images time-lapse du OER-GCaMP6f dans le même champ de vision, à 2 Hz pendant 2 min. sauvegarder les données sur le disque dur. Analyser les données en utilisant le logiciel d’analyse de l’image. Enregistrement de l’activité neuronale spontanée et Ca2 + élévation induite dans les neuronesRemarque : La configuration de microscope pour l’imagerie neuronale est la même que celle décrite dans la section 3.2. Ici, l’imagerie des spontanée Ca2 + élévation due à Lck-GCaMP6f et Ca2 + élévation induite par l’activation de mGluR en raison de l’OER-GCaMP6f est décrite. Pour enregistrer l’activité neuronale spontanée, monter la lamelle contenant les cellules exprimant Lck-GCaMP6f dans la chambre d’enregistrement et ajouter 400 µL de milieu d’imagerie. Placez un couvercle sur le dessus de la chambre. Définissez le filtre et la source de lumière (bleue excitation, p. ex. 470 – 790 nm ; voir Table des matières) à celles des GCaMP6f. Trouver les neurones exprimant Lck-GCaMP6f et montrant l’activité spontanée. Acquisition d’images à 2 Hz ou plus. Enregistrer les données sur le disque dur. Analyser les données en utilisant le logiciel d’analyse de l’image. Pour enregistrer Ca2 + élévation induite, monter les lamelles couvre-objet contenant les cellules exprimant OER-GCaMP6f avec 400 µL d’imagerie moyen. Placez un couvercle sur le dessus de la chambre. Utilisation du filtre pour GCaMP6f, trouver les neurones exprimant OER-GCaMP6f. Retirez le couvercle. Démarrer l’enregistrement time-lapse à 2 Hz ou plus. Lors de l’enregistrement, ajouter les agonistes pour un récepteur couplé aux protéines Gq (par exemple, mGluR5 agoniste [RS] – 3, 5 – dihydroxyphenylglycine [DHPG]) pour évoquer une libération de Ca2 + de l’ER. Sauvegarder les images de time-lapse sur le disque dur et analyser les données.

Representative Results

LCK-RCaMP2 et rel-GCaMP6f ont été exprimés dans les cellules HeLa, et les deux signaux ont été enregistrés simultanément à l’aide de partage d’image optique, 24h après la transfection (Figure 3 a et 1 vidéo). Les images ont été acquises à 10 Hz. Histamine (His, 1 µM), qui induit la libération de Ca2 + de la salle d’urgence, a été ajouté lors de l’enregistrement. Sur demande de son l’intensité du signal de Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f a augmenté, comme en témoigne l’affichage pseudo-couleur de ΔF/F0, qui représente la variation de l’intensité de fluorescence initiale (Figure 3 b). Les cours de temps d’élévation de Ca2 + (ΔF/F0) rapportés par Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f ont été comparées dans la même région d’intérêt (ROI) (Figure 3). Les valeurs ΔF/F0 ont été normalisés à leurs valeurs maximales pour permettre la comparaison temps de parcours entre les deux GECIs différents, qui ont des distributions et des niveaux d’expression différents. Les deux capteurs ont signalé une oscillation comme Ca2 + altitude. LCK-RCaMP2 et rel-GCaMP6f a montré l’évolution même de Ca2 + élévation dans deux cellules parmi les types de cinq cellules examinées (Figure 3, ROI 1 et 3). Cependant, Ca2 + élévations illustrées par Lck-RCaMP2 est resté à un niveau supérieur par rapport à celle montrée par rel-GCaMP6f (Figure 3 C, ROI 2, 4 et 5). Les résultats indiquent que l’élévation de Ca2 + se prolonge dans le voisinage de la membrane plasmique, bien qu’elle soit terminée plus tôt autour de l’ER, qui est la source de ce Ca2 + signal induite par sa stimulation. Spontanée Ca2 + des signaux d’astrocytes dans la culture d’hippocampe de rat (Figure 4 a) mixé neuron-astrocyte et cortex (Figure 4 b) ont été diffusés par Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f (Figure 4, vidéo 2, vidéo 3 de , Vidéo 4et vidéo 5). Cultures corticales ont été repris du stock congelé qui a été préparé comme décrit dans le présent protocole. LCK-RCaMP2 et rel-GCaMP6f signaux ont été enregistrées dans l’ordre à 2 Hz par les mêmes cellules. Trois ROIs ont été sélectionnés dans la zone qui a montré Ca2 + élévation par chaque GECI et l’évolution temporelle de ΔF/Fbase (c.-à-d., l’intensité de la fluorescence) est passé de l’intensité de la fluorescence moyenne pendant la période d’enregistrement entier (Fbase ). Si la fluorescence de la ligne de base est stable et Ca2 + élévations sont moins fréquentes, Fbase devient une base utile pour détecter les événements de Ca2 + élévation. Spontanée Ca2 + élévations étaient visibles seulement au processus astrocytaires, pas au corps cellulaire. Ce résultat concorde avec les rapports précédents sur les astrocytes Ca2 + signaux spontanées par d’autres GECIs visualisées in vitro13 et in vivo14. Dans les astrocytes hippocampe et cortex, Ca2 + élévations illustrées par Lck-RCaMP2 (haut) étaient plus fréquentes que celles indiquées par rel-GCaMP6f. Ce résultat est conforme à notre démonstration précédente que les Ca2 + élévations dans les astrocytes en raison Lck-GCaMP6f ont été détectées plus fréquemment que celles dues à OER-GCaMP6f7 et suggère que cette notion est également applicable à la niveau de la cellule unique. Spontanée Ca2 + élévations par Lck-GCaMP6f dans les neurones de l’hippocampe des rats immatures (10 DIV) ont été vus à 2 Hz (Figure 5 a et 6 de la vidéo). Les cours de temps de ΔF/F0 dans cinq différents ROIs suggèrent que ces Ca2 + élévations sont localement confinées aux domaines subcellulaires. Figure 5 b (Vidéo 7) montre les Ca2 + réponses dans des neurones hippocampal souris matures (30 DIV) infectés par des vecteurs d’AAV OER-GCaMP6f-expression. Les neurones ont été stimulées avec 100 µM DHPG, qui est l’agoniste des récepteurs métabotropiques du glutamate, induisant la libération de Ca2 + . DHPG Ca2 + libération induite en raison de l’OER-GCaMP6f a été détectée. Figure 1 : schéma montrant la membrane ciblées GECIs. Diagramme schématique de GECIs axés sur la membrane plasmique (Lck-GCaMP6f et Lck-RCaMP2) et ER externe ciblée membrane GCaMP6f (OER-GCaMP6f). Figure 2 : diagramme de flux pour la préparation de cellules hippocampiques et corticaux, transfection de plasmide et l’infection de l’AAV. Les images microscopiques sont représentatifs, fraîchement plaquée DIV-6 cellules corticales (à gauche) et relancé les cellules du stock congelé (à droite). Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : exemple de l’imagerie simultanée des Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f dans les cellules HeLa. (A) représentation schématique de la séparation du signal avec partage d’image optique. Le même champ de vision pour Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f est simultanément projetée sur la caméra. 1 vidéodonne un enregistrement représentant acquis à 10 Hz par une caméra CMOS, et une image de cet enregistrement est illustrée dans le groupe A (à droite). (B) des images de pseudo-couleur de ΔF/F0 pour Lck-GCaMP2 (en haut) et rel-GCaMP6f (en bas). L’histamine (His, 1 µM) a été ajouté à 0 s. (C) représentant cours heure normalisée de ΔF/F0 de Lck-GCaMP2 (magenta) et rel-GCaMP6f (vert). Les données ont été normalisées à la valeur maximale de ΔF/F0 pour chaque parcelle. Les barres grises indiquent le moment de son application. Données ont été analysées avec un logiciel sur mesure TI Workbench15. Echelle = 50 µm (image microscopique).  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Élévation2 + Ca spontanée dans les astrocytes surveillé d’expression Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f. (A) représentant hippocampique et (B) les astrocytes corticaux transfectées avec Lck-RCaMP2 (en haut) et rel-GCaMP6f (en bas). Les cellules corticales ont été repris de cultures mères congelées. LCK-RCaMP2 et rel-GCaMP6f images ont été acquises dans l’ordre dans la même cellule, à 2 Hz, avec une caméra CCD-EM. Les parcelles sur le spectacle de gauche les cours du temps de ΔF/Fbase mesurées dans la ROIs indiquent dans l’image microscopique. Données ont été analysées avec TI Workbench. Films réels sont fournis dans la vidéo 2, vidéo 3, vidéo 4et 5 de la vidéo. La barre d’échelle = 20 µm (image microscopique). La dérive de référence suggère les changements dans le niveau2 + Ca global dans la cellule.  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Exemples de Ca2 + imagerie dans les neurones avec Lck-GCaMP6f et rel-GCaMP6f. (A) représentant rat neurones de l’hippocampe exprimant Lck-GCaMP6f à 10 DIV (à gauche) et tracés indiquant l’heure des cours de ΔF/F0 mesurée dans la ROIs (cercles jaunes) sont indiquées dans l’image (à droite). Les numéros dans le décours temporel correspondent aux numéros ROI dans l’image. Notez que le patron temporel de Ca2 + élévation est différent entre les diverses régions d’intérêt. La dérive de la ligne de base indique l’augmentation du Ca2 + niveau global dans ce neurone. (B) un exemple de souris adultes neurones de l’hippocampe (DIV 30) infectés par des vecteurs d’AAV expression OER-GCaMP6f (à gauche). L’heure de cours de ΔF/F0 mesurée indique la réponse Ca2 + à 100 µM (RS) – 3, 5 – dihydroxyphenylglycine (DHPG) appliquée à la date indiquée par la barre grise. Cercles jaunes indiquent la position des ROIs où l’évolution temporelle a été obtenue. Les images ont été acquises à 2 Hz avec une caméra CCD refroidi (groupe A) ou une EM-CCD caméra (groupe B) et analysées avec TI Workbench. Echelle = 20 µm (image microscopique). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Vidéo 1 : exemple de l’imagerie simultanée de Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f dans les cellules HeLa. Enregistrement représentant acquis à 10 Hz et présenté à la Figure 3. Echelle = 50 µm.  S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo. Vidéo 2 : Spontanée de Ca2 + transitoire observé dans Lck-RCaMP2 dans l’hippocampe astrocyte. Enregistrement représentant acquis à 2 Hz (Figure 4 a), enregistrées dans le même champ de vision en vidéo 3. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo. Vidéo 3 : Spontanée de Ca2 + transitoires observés dans OER-GCaMP6f en un hippocampe astrocyte. Enregistrement représentant acquis à 2 Hz (Figure 4 a), dans le même champ de vision en tant que vidéo 2. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo. Vidéo 4 : Spontanée de Ca2 + transitoire chez Lck-RCaMP2 dans un astrocyte corticale enregistrement représentant acquis à 2 Hz (Figure 4 b), enregistrées dans le même champ de vision comme vidéo 5. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo. Video 5 : Spontanée de Ca2 + transitoires observés dans OER-GCaMP6f en un astrocyte corticale. Enregistrement représentant acquis à 2 Hz (Figure 4 b), dans le même champ de vision en tant que vidéo 4. La barre d’échelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo. Video 6 : Exemple de Ca2 + imagerie dans un neurone hippocampe de rat (DIV 10) par Lck-GCaMP6f. Exemple de neurones Ca2 + des signaux enregistrés à 2 Hz (Figure 5 a). Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo. Vidéo 7 : Ca2 + sortie dans un neurone hippocampe de souris (30 DIV), exprimant des OER-GCaMP6f. Exemple de Ca2 + signaux neurones enregistré dans un neurone hippocampe de souris infecté par des vecteurs d’AAV expression OER-GCaMP6f (Figure 5 b). Le neurone est stimulé avec 100 µM dihydroxyphenylglycine (DHPG) appliqué à 30 s pour évoquer la libération de Ca2 + de l’ER. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Divers produits biologiques sont initiées par des signaux de Ca2 + . Ca2 + est un messager de signalisation intracellulaire versatile. Décodage des signaux de Ca2 + pour évoquer les résultats précis a été une question biologique fondamentale, et Ca2 + techniques d’imagerie pour décrire la diversité des signaux de Ca2 + sont requis. Le protocole actuellement détaillé permet la détection de Ca2 + signaux distincts à la membrane plasmique et ER (Figure 3 et Figure 4) et de Ca2 + microdomaines locales à l’intérieur d’une cellule (Figure 4 et Figure 5). Ceci contribue à décrire la diversité des signaux intracellulaires de Ca2 + . La résolution temporelle de Ca2 + des signaux a été également améliorée en ciblant GECIs dans la membrane plasmique et ER, car elle peut éviter l’effet d’une diffusion en trois dimensions du Ca2 + et GECIs eux-mêmes, et il a le potentiel pour détecter la moment même de l’influx de Ca2 + ou libération Ca2 + , ce qui se produit sur la membrane.

Le protocole a quelques limitations. Utilisateurs doivent garder à l’esprit que les signaux détectés sont la sommation du « moment d’influx de Ca2 + ou release » et « Ca2 + diffusé sur de l’origine de Ca2 + », surtout pour les signaux de grande Ca2 + . Par exemple, bien que sa stimulation dans les cellules HeLa évoque Ca2 + la libération de l’ER, sa résultante Ca2 + signaux sont détectées non seulement par rel-GCaMP6f ER ciblées, mais aussi par plasma membrane ciblées Lck-RCaMP2 (Figure 3). Une autre limitation est que la configuration spatio-temporelle des signaux2 + Ca peut être pas le seul déterminant de la production de signaux de Ca2 + . La distribution des protéines effectrices en aval (par exemple Ca2 +-dependent kinases et phosphatases) peut également être un facteur déterminant en2. Pour complètement décoder les signaux intracellulaires de Ca2 + , analyse du comportement de l’enzyme en aval, qui n’est pas couvert par le présent protocole, est absolument nécessaire.

Un des aspects plus critiques pour l’imagerie réussie de Ca2 + est l’acquisition d’imagerie de configuration et de l’image, aussi bien les conditions en ce qui concerne les autres études d’imagerie en direct. Nous avons montré précédemment que les réponses du Ca2 + dans la cellule sont fortement dépendantes sur la durée et l’intensité de l’excitation et image acquisition conditions, y compris l’exposition temps et acquisition de fréquence16. Puissance d’éclairage excitation est le facteur le plus critique, car il peut causer légère toxicité et Photoblanchiment de GECIs. Les conditions d’enregistrement des temps d’exposition, fréquence, intensité lumineuse excitation et la durée d’enregistrement d’enregistrement doivent être optimisées selon le but de l’expérience. Il est recommandé de réduire la durée d’exposition et de l’intensité lumineuse excitation autant que possible afin d’éviter le Photoblanchiment et phototoxicité à la cellule. La fréquence de l’enregistrement et la durée de l’enregistrement devraient être suffisants pour couvrir les événements d’intérêt Ca2 + altitude mais doivent être maintenus aussi basses que possible afin d’éviter le Photoblanchiment et phototoxicité également. Nous vous recommandons déterminant la fréquence de l’enregistrement et la durée d’abord et d’optimiser l’intensité lumineuse et la durée d’exposition, afin que le Photoblanchiment des GECIs est réduit au minimum. Un autre facteur important est le niveau d’expression des GECIs. GECIs ont un Ca2 +-effet tampon car elles sont Ca2 +-protéines de liaison. Par conséquent, la surexpression de GECIs entraîne la bufferisation de Ca2 +, qui est physiologiquement nécessaire pour les cellules. La quantité d’expression GECI devrait être minimisée pour éviter d’imagerie de cellules exprimant des quantités élevées de GECIs.
 
En conclusion, la dissection des signaux de Ca2 + à une résolution subcellulaire est l’une des étapes plus importantes pour le décodage des signaux2 + Ca intracellulaires qui déterminent le phénomène biologique de sortie. Ce protocole prévoit une nouvelle méthode pour la dissection des signaux de Ca2 + pour décrire la diversité parmi ces signaux. Actuellement, cette technique est limitée pour des expériences in vitro. Toutefois, Lck-GCaMP6f est déjà utilisé pour l’imagerie in vivo Ca2 + souris17et rel-GCaMP6f a été confirmée pour surveiller Ca2 + signaux in vivo chez les neurones moteurs VD chez c. elegans7. Ciblage GECIs dans le compartiment subcellulaire a donc le potentiel d’être étendu à in vivo d’imagerie à l’avenir, donc in vivo permettant la dissection Ca2 + .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par les subventions suivantes : la Japan Science and Technology Agency (JST) / Precursory recherche embryonnaire sciences et technologie (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japon) ; la société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS) / subventions en aide à la recherche scientifique (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), fondation de Takeda. Les auteurs remercient Haruhiko Bito (Université de Tokyo) pour la fourniture de RCaMP2 et Arthur J.Y. Huang et Thomas McHugh (RIKEN CBS) pour la fourniture des vecteurs d’AAV et pour obtenir des instructions concernant la préparation de l’AAV. Les auteurs tiens également à remercier les éditeurs dans le Journal of Visualized Experiments pour leur aide avec vidéo de tournage et de montage.

Materials

(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) Tocris #0342
0.5% DNase I stock solution Sigma-Aldrich #11284932001 Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution  supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30°C.
0.5% Trypsin-EDTA solution Thermo Fisher Scientific #25300054
100 mM L-glutamine (×100 stock) Thermo Fisher Scientific #25030081 Preparing small aliquots of 250–750 µL and store at -30°C.
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) Thermo Fisher Scientific #11360070 Aliquots (10 mL) can be stored at -20°C. After thawing, the solution can be maintained at 4°C for 2 months.
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid Falcon #353043 Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.
18-mm diameter circular coverslips Karl Hecht "Assistent" #41001118 Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.
1M HEPES Thermo Fisher Scientific #15630080 pH 7.2 – 7.6
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) Sigma-Aldrich #T4674 Prepare 150 µL aliquot and store at -30°C.
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution  Sigma-Aldrich #P3143 Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30°C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.
70% Ethanol Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and  pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.
B-27 supplement (×50 stock) Thermo Fisher Scientific #17504044 This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).
B57BL/6 Japan SLC, Inc.
Camera for microscopic image recording The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,  ImagEM; Andor, iXon) or  CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Cell freezing container Sarstedt K.K. #95.64.253 Alternative cell freezing container can be used.
Cell strainer Falcon #352350
CO2 incubator Maintain at 37°C, 5% CO2.
Cryogenic tube Corning #430661 Alternative cryogenic tubes can be used.
Cryopreservation medium Zenoaq "CELLBANKER1"
Culture medium (for HeLa cells) Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 µg/mL)
Dissection medium  One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM 
DMEM Nacalai #08456-65 Alternative DMEM can be used.
DMEM Nacalai #08456-65 Low glucose
DNA transfection reagent Sigma-Aldrich #6366244001 "X-tremegene HP DNA transfection reagent"
Alternative transfection reagents can be used.
Glass jar with a lid 500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal 
HBSS Thermo Fisher Scientific #14170161 HBSS free of calcium and magnesium
Heat inactivated bovine serum Thermo Fisher Scientific #10100147
HeLa cells RIKEN BioResource Center #RCB0007
Histamine Sigma-Aldrich #H7125
Image analysis software Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made) 
Image splitting optics Hamamatsu Photonics #A12801-01 W-view GEMINI
Image splitting optics dichroic mirror Semrock #FF560-FDi01-25×36 For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein  (GFP/RFP) signal
Image splitting optics emission filters Semrock #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 For emission of GFP/RFP signal, respectively
Imaging medium and buffer Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.
Incubation saline  Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS
Inverted fluorescence microscope Such as IX73 (Olympus) or  Eclipse TI (Nikon Instech)
Isoflurane Pfizer Used for anesthesia
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution.
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes)  12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution.
MEM (Minimum Essential Medium) Thermo Fisher Scientific #11090-081
Microscope filter set for GCaMP6f imaging Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm)
Microscope filter set for RCaMP2 imaging Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass)
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f Semrock #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.
Microscope heating system A heating system to maintain cells at 37°C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.
Microscope light source for excitation Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.
Microscope objective lens Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.
Neurobasal plus medium Thermo Fisher Scientific #A3582901
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher Scientific #10888022 Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+  Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation #164-23551 The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.
PC and image acquisition software Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.
Penicillin-Streptomycin solution Thermo Fisher Scientific #15140122 Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL 
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 Available upon request
Plating medium (for 4 × 12 well dishes) 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of  the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.
Recording chamber Elveflow Ludin Chamber This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.
Reduced serum media Thermo Fisher #11058021 Opti-MEM
Stereomicroscope Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.
Surgical instruments Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,  3 forceps with fine tips  (Dumont Inox #5)
Transfection reagent for neuron Thermo Fisher Scientific #L3000008 "Lipofectamine 3000" reagent.
It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4.
Trypan blue (0.4%) Thermo Fisher Scientific #15250061
Wash medium for frozen cortical cells  25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin.
Wistar rats Japan SLC, Inc Pregnant rats (E18)
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References

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Bannai, H., Hirose, M., Niwa, F., Mikoshiba, K. Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (145), e59246, doi:10.3791/59246 (2019).
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